Catch Me If You Can

Czyli dlaczego skrawki parafinowe odklejaja sie od szkielka w IHC i ISH

Jest taki moment w pracowni histopatologicznej, którego nikt nie lubi.

Preparat wygląda dobrze, skrawek został prawidłowo przeniesiony na szkiełko, te spędziło kilka minut na płycie, godzinę w cieplarce, "jednym słowem" wszystko dobrze. Później preparat trafia do procedury immunohistochemicznej albo hybrydyzacji in situ i nagle skrawek postanowił rozpocząć własną karierę.

Odkleił się. Podwinął. Spłynął. Zniknął z pola diagnostycznego. Czasem w całości, czasem tylko częściowo, ale oczywiście najchętniej tam, gdzie materiał był najważniejszy. Jeszcze częściej gdy mamy go mało. I prawie na pewno, kiedy to było ostatnie szkiełko.

Wtedy zaczyna się panika, potem próba ratowania, która bardzo często kończy się niepowodzeniem i na końcu szukanie winnego.

Czy winna jest barwiarka? Czy bufor był zbyt agresywny? Czy odzyskiwanie antygenu trwało za długo? Czy skrawek był źle wysuszony? Czy materiał był trudny? Czy technik coś zrobił nie tak?

Czasem odpowiedź brzmi: tak.

Ale bardzo często trzeba zadać pytanie wcześniejsze i mniej efektowne:

Na jakim szkiełku leżał ten skrawek?

Bo w IHC i ISH szkiełko mikroskopowe nie jest zwykłym kawałkiem szkła. Jest elementem procesu preanalitycznego. A od jego powierzchni może zależeć to, czy tkanka przetrwa odparafinowanie, odzyskiwanie antygenu, enzymy, podgrzewanie, płukania, bufory i kolejne inkubacje.

Szkiełko nie jest neutralnym tłem

Zwykłe szkło jest chemicznie dość bierne. Jeśli nie zostanie odpowiednio zmodyfikowane, skrawek trzyma się głównie dzięki słabym oddziaływaniom, wysuszeniu i temu, że „zwykle jakoś działa”. W rutynowym H&E często wystarcza to na długo. W IHC i ISH zaczynają się schody.

W wielu materiałach szkoleniowych zwraca się uwagę, że IHC i ISH należą do technik szczególnie ryzykownych pod kątem utraty tkanki, ponieważ łączą wysoką temperaturę, enzymy, chemikalia i powtarzane płukania. W przypadku ISH jest jeszcze bardziej wymagająco. Długie, rygorystyczne płukania a także znacznie wyższa niż w IHC temperatura nie pomagają w utrzymaniu materiału, dlatego stosowanie szkiełek powlekanych wydaje się być krytyczne.

Czy przetrwa cały proces?

Jakie szkiełka mamy do wyboru?

W praktyce laboratoryjnej spotykamy kilka głównych typów szkiełek używanych do lepszej adhezji tkanki. Nazwy bywają mylące, bo producenci stosują różne określenia: adhezyjne, powlekane, dodatnio naładowane, silanizowane, polilizynowe, hydrofilowe. To nie zawsze są synonimy.

1. Szkiełka silanizowane

Szkiełka silanizowane są modyfikowane z użyciem związków silanowych, najczęściej pochodnych aminosilanów. Ich zadaniem jest stworzenie warstwy pośredniej między szkłem a tkanką. Powierzchnia szkła zawiera grupy hydroksylowe, z którymi silany mogą tworzyć wiązania, a dostępne grupy aminowe pomagają w przyciąganiu ujemnie naładowanych struktur biologicznych.

Zalety: Silanizacja może dawać bardzo dobrą adhezję. Takie szkiełka są od dawna stosowane w histologii, IHC i ISH. Są szczególnie przydatne tam, gdzie skrawek musi przetrwać intensywniejsze procedury niż klasyczne barwienie rutynowe. W literaturze opisywano silanizowane szkiełka jako rozwiązanie poprawiające wiązanie skrawków w rutynowej histologii, immunohistochemii i hybrydyzacji in situ.

Wady: Silanizacja jest bardzo wrażliwa na sposób wykonania. Liczy się czystość szkła, aktywacja powierzchni, stężenie silanu, rozpuszczalnik, wilgotność, temperatura, liczba płukań, suszenie i utwardzanie warstwy. Zbyt gruba lub nierównomierna warstwa nie musi oznaczać lepszej adhezji. Może być mniej stabilna. Warstwy silanowe różnią się między producentami m. in. grubością, pokryciem powierzchni, sposobem nakładania, stężeniem silanu, myciem i suszeniem.

Aminosilany mają jeszcze jedną ważną cechę: ich stabilność w środowisku wodnym zależy od struktury chemicznej i warunków przygotowania. W pracy Smith i Chen wykazano, że funkcjonalizowane aminosilanami powierzchnie krzemionkowe mogą tracić funkcjonalność po ekspozycji na wodę w 40°C, a zjawisko to wiązano z hydrolizą wiązań siloksanowych katalizowaną przez grupy aminowe.

W skrócie: silanizacja może być świetna, ale tylko wtedy, gdy jest dobrze i powtarzalnie wykonana.

2. Szkiełka polilizynowe

Szkiełka polilizynowe są pokrywane poli-L-lizyną, czyli polimerem aminokwasu lizyny. Taka warstwa nadaje powierzchni dodatni charakter i pozwala przyciągać ujemnie naładowane struktury tkankowe.

Zalety: To rozwiązanie proste, znane i od dawna stosowane. Już klasyczne prace dotyczące immunocytochemii opisywały poli-L-lizynę jako metodę poprawy przylegania skrawków do szkiełek.

Wady: Polilizyna nie zawsze wytrzymuje agresywne warunki IHC i ISH tak dobrze jak nowoczesne powierzchnie specjalistyczne. W badaniu dotyczącym trudnych do utrzymania skrawków, opisanym w bazie NCI Biospecimen Research Database, szkiełka pokryte chronionym izocyjanianem wypadały lepiej niż szkiełka aminosilanowe, poli-L-lizynowe i polysine po IHC oraz barwieniach histologicznych. W części przypadków istotny diagnostycznie fragment tkanki był widoczny tylko na szkiełkach PI-coated, a na innych typach szkiełek został utracony.

Polilizyna może być bardzo użyteczna, ale nie jest odpowiedzią na każdy problem. Szczególnie wtedy, gdy protokół obejmuje wysoką temperaturę, agresywne odzyskiwanie antygenu albo liczne płukania.

3. Szkiełka dodatnio naładowane

To bardzo szeroka kategoria. Szkiełka dodatnio naładowane mają powierzchnię przyciągającą ujemnie naładowane elementy tkanki. W praktyce często stosuje się je do IHC, ponieważ poprawiają retencję materiału w porównaniu ze szkłem niemodyfikowanym.

Zalety: Są uniwersalne, łatwo dostępne i powszechnie stosowane. W wielu protokołach IHC zaleca się montowanie skrawków FFPE na szkiełkach typu Superfrost Plus albo innych dodatnio naładowanych szkiełkach, a następnie suszenie w odpowiedniej temperaturze, żeby ułatwić przyczepienie tkanki.

Wady: „Dodatnio naładowane” nie mówi wszystkiego. To może oznaczać różne technologie powierzchni, różną gęstość grup aminowych, różną hydrofobowość, różną stabilność i różną trwałość efektu. Dodatkowo sama obecność ładunku dodatniego nie gwarantuje, że skrawek przetrwa HIER, wysokie pH, enzymy i wieloetapowe płukania.

Warto pamiętać, że szkiełka powlekane także się starzeją. Powierzchnia chemiczna może zmieniać się w czasie i pod wpływem temperatury. Z danych wynika, że szkiełka naładowane mogą z czasem tracić swoje właściwości, a niewłaściwe przechowywanie, na przykład w wysokiej temperaturze, może zmienić zachowanie powłoki.

4. Szkiełka hydrofilowe

Szkiełka hydrofilowe są szczególnie ciekawe, bo rozwiązują nie tylko problem „czy tkanka się trzyma”, ale też problem „jak zachowuje się ciecz na powierzchni”.

W IHC i ISH odczynniki są wodne. Przeciwciała, bufory, roztwory płuczące, sondy, reagenty detekcyjne — wszystko to musi równomiernie pokryć skrawek. Jeżeli powierzchnia jest zbyt hydrofobowa, kropla może tworzyć kopułę, odsuwać się od części preparatu, zostawiać pęcherzyki powietrza albo nierównomiernie rozprowadzać odczynnik. To może wpływać nie tylko na komfort pracy, ale też na jakość reakcji.

Zalety: Dobre szkiełko hydrofilowe łączy dwie cechy: przyczepność i zwilżalność. Dzięki temu skrawek leży stabilnie, a odczynnik łatwiej rozprowadza się po powierzchni. To szczególnie ważne w automatycznej IHC i ISH, gdzie liczy się powtarzalna dystrybucja cieczy.

W badaniu prezentowanym na USCAP 2014 porównano szkiełka hydrofilowe i hydrofobowe w IHC. Szkiełka hydrofilowe miały znacznie mniejszy kąt kontaktu kropli wody, około 15°, podczas gdy badane szkiełka hydrofobowe miały średnio około 38,8°. W tym samym badaniu szkiełka hydrofilowe zawierały około trzykrotnie więcej grup aminowych niż szkiełka hydrofobowe i ponad trzydziestokrotnie więcej niż szkło niepowlekane. Uzyskano też najwyższą retencję tkanki, w zakresie 90–100%, podczas gdy badane szkiełka hydrofobowe osiągały znacznie niższe wartości.

Wady: Szkiełko hydrofilowe nie jest magiczne. Jeśli tkanka jest źle utrwalona, skrawek jest zbyt gruby, suszenie było niewystarczające, kąpiel wodna była zanieczyszczona albo protokół odzyskiwania antygenu jest zbyt agresywny, nawet najlepsza powierzchnia nie uratuje wszystkiego.

Druga wada jest bardziej praktyczna: dobre hydrofilowe szkiełka są zwykle droższe. Ale w IHC i ISH trzeba liczyć koszt całego procesu, nie tylko koszt jednego szkiełka.

Dlaczego hydrofilowe powierzchnie tak dobrze pasują do IHC i ISH?

Bo IHC i ISH są procesami wodnymi, wieloetapowymi i wrażliwymi na nierównomierność.

W immunohistochemii skrawek przechodzi przez odparafinowanie, rehydratację, odzyskiwanie antygenu, blokowanie, inkubację z przeciwciałami, detekcję, chromogen, kontrastowanie i płukania. Każdy etap to ryzyko mechaniczne i chemiczne. HIER może prowadzić do utraty tkanki, szczególnie gdy dochodzi do gwałtownego gotowania, nierównomiernego ogrzewania albo pracy w warunkach wysokiego pH.

W ISH dochodzi jeszcze praca z kwasami nukleinowymi, sondami, temperaturą, proteolizą i płukaniami. Tutaj tkanka musi nie tylko „leżeć”, ale przetrwać cały proces bez utraty sygnału i bez degradacji materiału docelowego. Dlatego przy ISH znaczenie mają jednocześnie: adhezja, czystość, brak RNaz/DNaz, stabilność powierzchni i powtarzalność rozprowadzania reagentów.

Hydrofilowość jest korzystna, bo poprawia zwilżanie. Kropla nie siedzi na powierzchni jak kulka na liściu lotosu, tylko rozlewa się szerzej i bardziej równomiernie. Mniej jest miejsc suchych, mniej pęcherzyków powietrza, mniej lokalnych różnic w ekspozycji skrawka na reagent.

To ważne szczególnie w automatach IHC/ISH.

Automat może perfekcyjnie dozować reagent. Ale jeśli powierzchnia szkiełka źle go rozprowadza, to perfekcyjne dozowanie nie oznacza perfekcyjnego kontaktu z tkanką.

Dlaczego jedne szkiełka są mocniejsze od innych?

Najprostsza odpowiedź brzmi: bo różnią się powierzchnią.

Bardziej precyzyjna odpowiedź brzmi: bo różni się cały proces produkcyjny.

Na finalną jakość szkiełka wpływa kilka elementów:

1. Jakość szkła bazowego Szkło może różnić się składem, czystością, właściwościami optycznymi i termicznymi. Szkło białe jest zwykle traktowane jako bardziej „laboratoryjne” i stabilniejsze niż tańsze, tradycyjne szkło sodowo-wapniowe, choć samo szkło bazowe nie rozwiązuje jeszcze problemu adhezji.

2. Przygotowanie powierzchni Powierzchnia przed powlekaniem musi być czysta i odpowiednio aktywowana. Zanieczyszczenia, pozostałości procesu produkcyjnego, pył, tłuszcze albo nierównomierna aktywacja mogą zaburzyć wiązanie powłoki z powierzchnią szkła.

3. Chemia powłoki Nie każda powłoka „plus” albo „adhesive” oznacza to samo. Liczy się rodzaj zastosowanego silanu, polimeru albo mieszaniny powierzchniowej, liczba dostępnych grup aminowych, hydrofilowość, hydrofobowość i stabilność warstwy.

4. Grubość warstwy Więcej nie zawsze znaczy lepiej. Zbyt gruba warstwa silanowa może być mniej stabilna, bardziej nierówna i bardziej podatna na odrywanie. W materiałach Leica podkreślono, że liczba warstw molekularnych ma znaczenie, a nadmierna liczba warstw może prowadzić do niestabilności i utraty tkanki.

5. Jednorodność pokrycia Szkiełko może mieć dobrą powłokę średnio, ale słabą lokalnie. A skrawek nie odpada „średnio”. Odpada tam, gdzie trafi na słabszy fragment powierzchni.

6. Mycie, suszenie i utwardzanie To etap, który często decyduje, czy powłoka będzie stabilna. W badaniach nad aminosilanami wskazywano, że rozpuszczalniki, ilość wody, temperatura, czas reakcji, płukanie i suszenie są krytyczne dla jakości oraz stabilności warstwy.

7. Kontrola jakości Dobre szkiełko powinno być kontrolowane nie tylko wymiarowo. W idealnym świecie producent sprawdzałby także właściwości powierzchni: zwilżalność, kąt kontaktu, jednorodność powłoki, stabilność ładunku, czystość i powtarzalność między partiami.

Europa kontra Azja — o co naprawdę chodzi?

To jest temat niebezpieczny, który łatwo uprościć, ale nie warto.

Nie chodzi o to, że szkiełko wyprodukowane w Azji z definicji jest złe. Takie twierdzenie byłoby nierzetelne. W Azji powstają zarówno produkty bardzo dobre, jak i bardzo przeciętne. W Europie również można wyprodukować produkt lepszy albo gorszy.

Realna różnica często nie wynika z geografii, tylko z modelu produkcji.

Jeżeli porównujemy tanie, masowe szkiełko importowe z produktem europejskim klasy premium, różnić mogą się:

• powtarzalność szkła bazowego,

• czystość powierzchni przed powlekaniem,

• sposób aktywacji szkła,

• rodzaj i stabilność powłoki,

• kontrola wilgotności podczas procesu,

• kontrola temperatury i czasu utwardzania,

• grubość warstwy adhezyjnej,

• równomierność pokrycia,

• liczba i jakość płukań,

• warunki pakowania,

• ochrona przed wilgocią,

• kontrola każdej partii,

• stabilność właściwości w czasie.

To są realne powody, dla których jedno szkiełko może być „mocniejsze” od drugiego.

Nie dlatego, że ma inne pochodzenie na etykiecie.

Tylko dlatego, że jego powierzchnia jest lepiej zaprojektowana, lepiej wykonana i lepiej kontrolowana.

W przypadku szkiełek hydrofilowych różnica może być szczególnie widoczna. Tu nie wystarczy „coś nanieść na szkło”. Trzeba uzyskać powierzchnię, która jednocześnie dobrze trzyma tkankę i dobrze rozprowadza wodne odczynniki. To trudniejsze niż wykonanie powierzchni po prostu „lepkiej” albo po prostu „naładowanej”.

Dlatego dobre hydrofilowe szkiełko jest produktem bardziej zaawansowanym, niż wygląda.

Podsumowanie

Skrawek parafinowy rzadko odpada bez powodu.

Czasem winna jest tkanka. Czasem suszenie. Czasem zbyt agresywne odzyskiwanie antygenu. Czasem bufor, temperatura albo mechanika procesu.

Ale bardzo często początek problemu leży w wyborze szkiełka.

Silanizowane, polilizynowe, dodatnio naładowane i hydrofilowe szkiełka nie są tym samym. Każde rozwiązanie ma swoje zalety i ograniczenia. Polilizyna jest prosta i znana, ale nie zawsze wystarcza do agresywnych procedur. Silanizacja może dawać mocne wiązanie, ale wymaga bardzo dobrej kontroli procesu. Szkiełka dodatnio naładowane są uniwersalne, ale sama nazwa nie mówi nic o realnej sile i stabilności powierzchni. Szkiełka hydrofilowe są szczególnie interesujące w IHC i ISH, bo łączą adhezję z lepszym rozprowadzaniem wodnych reagentów.

W świecie automatycznej IHC i ISH to połączenie ma ogromne znaczenie.

Bo skrawek nie ma tylko przetrwać momentu naklejenia.

Ma przetrwać cały proces.

Od mikrotomu do wyniku.

I najlepiej, żeby nie traktował procedury jak sceny ucieczki z filmu.

Praktyczna rada LPE: Jeśli w pracowni pojawia się problem odpadających skrawków w IHC lub ISH, nie zaczynaj diagnostyki od obwiniania barwiarki. Najpierw sprawdź: typ szkiełka, warunki suszenia, grubość skrawka, kąpiel wodną, rodzaj materiału, protokół HIER, pH buforu i partię szkiełek. Bardzo często problem zaczyna się wcześniej, niż widać go w aparacie.