"Zawsze wydawał się taki dobry. Spokojny. Nieproblematyczny."

Dlaczego utrwalacz bywa najcichszą zmienną w patomorfologii

Nie wymagał uwagi.

Nie wymuszał zmian protokołów.

Nie prowokował pytań.

Był po prostu obecny. W tle codziennej pracy laboratoryjnej, tak oczywisty, że z czasem przestawało się go zauważać. Element krajobrazu patomorfologii – równie naturalny jak mikrotom czy łaźnia wodna. Nawet zapach, początkowo drażniący, z czasem stawał się akceptowalny, a w pewnym sensie wręcz „normalny”.

Przez długi czas wszystko działało. Wyniki FISH, CISH i IHC były powtarzalne, przewidywalne, „czyste”. Barwienia H&E wyglądały dokładnie tak, jak powinny – stabilne, czytelne, gotowe do oceny. Nic nie sugerowało, że cokolwiek wymaga interwencji.

Aż któregoś dnia coś przestało się zgadzać.

Pierwsze, niemal niewidoczne pęknięcia

Na początku zmiany były subtelne. Pojedyncze preparaty wyglądały trochę inaczej niż zwykle. Sygnał w IHC stawał się mniej jednoznaczny. Barwa H&E po czasie traciła intensywność. Pojawiały się drobne artefakty – sporadyczne „blue blobs”, pojedyncze pęknięte jądra, delikatne zanieczyszczenia eozyną w tle.

Nie był to dramat ani oczywista awaria. Raczej narastające wrażenie, że obraz nie do końca odpowiada temu, czego się spodziewaliśmy.

Z czasem zaczęły pojawiać się pytania. Dlaczego sygnał FISH nie jest już tak wyraźny jak wcześniej? Dlaczego CISH, dotąd spokojne i jednoznaczne, nagle wymaga dłuższej analizy? Dlaczego preparaty H&E, jeszcze niedawno stabilne, zaczynają wyglądać tak, jakby coś z nich powoli „uciekało”?

Nie było jednego momentu, w którym można by wskazać awarię. Nie było dnia, w którym coś się zepsuło. Była jedynie narastająca niepewność i zdanie, które w diagnostyce zawsze brzmi podejrzanie:„Przecież nic nie zmienialiśmy”.

Bo w patomorfologii „nic się nie zmieniło” bardzo rzadko oznacza, że rzeczywiście nic się nie zmieniło. Znacznie częściej oznacza, że zmiana była tak podstawowa, że przestała być postrzegana jako zmienna.

Utrwalanie nigdy nie było neutralne

Patomorfologia wie o tym od dawna. Już klasyczne prace Wernera i współpracowników pokazały, że utrwalanie formaliną nie ogranicza się do zachowania architektury tkanki. Formaldehyd prowadzi do kowalencyjnego sieciowania białek, zmian ich konformacji oraz maskowania epitopów istotnych diagnostycznie, co bezpośrednio wpływa na wyniki immunohistochemii.

Kolejne badania potwierdziły, że różne utrwalacze – nawet jeśli zapewniają porównywalną jakość morfologiczną w rutynowym barwieniu H&E – mogą istotnie różnić się wpływem na immunoreaktywność, jakość sygnału w technikach ISH oraz długoterminową stabilność preparatów.

I właśnie tu pojawia się paradoks najbardziej zdradliwy dla rutyny diagnostycznej. Morfologia może wyglądać poprawnie. Preparat „trzyma formę”. A jednocześnie na poziomie molekularnym zachodzą zmiany, które nie są widoczne gołym okiem, ale mają realne konsekwencje interpretacyjne.

Od mikroskopu do molekuł

Wraz z upowszechnieniem diagnostyki molekularnej znaczenie utrwalania przestało być wyłącznie „histologiczne”. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) stało się integralną częścią patomorfologii, a materiał FFPE – mimo swojej użyteczności – niesie ze sobą dobrze opisane ograniczenia.

Utrwalanie formaliną prowadzi do chemicznych modyfikacji kwasów nukleinowych, w tym deaminacji cytozyny, skutkującej charakterystycznymi artefaktami C>T oraz G>A. Jest to swoisty „chemiczny podpis” materiału FFPE – zmiany, które w danych NGS mogą wyglądać jak fałszywe warianty.

Oczywiście opracowano strategie ograniczania tych efektów: ocenę jakości DNA, enzymatyczną naprawę, kryteria analityczne i filtry bioinformatyczne. Dzięki temu FFPE pozostaje materiałem akceptowalnym diagnostycznie – pod warunkiem, że preanalityka i kontrola jakości nie są traktowane jako formalność.

A preanalityka zaczyna się właśnie na etapie utrwalania.

Gdy rutyna przestaje wystarczać

W takich sytuacjach laboratoria reagują przewidywalnie. Sprawdza się serie odczynników, daty ważności, nowe partie przeciwciał, parametry aparatów, kontrole dodatnie i ujemne. Z reguły wszystko się zgadza.

Powtarza się barwienia, wydłuża inkubacje, koryguje HIER. Czasem coś się poprawia, czasem nie. Wyniki pozostają „akceptowalne”, ale coraz rzadziej dają to poczucie spokoju, które wcześniej było oczywiste.

I właśnie wtedy pojawia się pytanie, którego nie ma w żadnym SOP-ie: a może to nie marker?

Bo marker można zmienić, protokół zoptymalizować, a aparat skalibrować. Ale jest coś, co zawsze było na swoim miejscu. Co nigdy nie było problemem. Co nie wymagało dyskusji.

Utrwalacz.

Fundament, który się starzeje

Formaldehyd jest związkiem lotnym i reaktywnym. Dyfunduje, paruje, reaguje. Z czasem przestaje być tym samym roztworem, którym był w dniu przygotowania – nawet jeśli wizualnie wygląda „tak samo”.

To nie jest moment awarii.To moment utraty przewidywalności.

I właśnie ta utrata przewidywalności jest najbardziej niebezpieczna, bo zachodzi powoli i bez wyraźnych sygnałów ostrzegawczych.

Bezpieczeństwo punktowe to za mało

Przez lata wdrażano rozwiązania mające ograniczyć ekspozycję na formalinę: zamknięte pojemniki, wkłady absorbujące, systemy stosowane bezpośrednio po pobraniu materiału. Realnie poprawiło to bezpieczeństwo w określonych punktach procesu – szczególnie na bloku operacyjnym.

Problem polega na tym, że formalina nie kończy swojej drogi w chwili zamknięcia pojemnika. Towarzyszy procesowi grossingu, pracy procesora tkankowego, archiwizacji bloczków i ich utylizacji. Ekspozycja personelu patomorfologii jest rozciągnięta w czasie i często mniej widoczna – a przez to łatwiej bagatelizowana.

Z punktu widzenia prawa nie ma znaczenia, gdzie ekspozycja jest największa. Liczy się fakt, że występuje w wielu punktach tego samego procesu.

Formaldehyd jako substancja regulowana

Formaldehyd został sklasyfikowany w Unii Europejskiej jako substancja rakotwórcza kategorii 1B zgodnie z rozporządzeniem CLP. Ta klasyfikacja pociąga za sobą bardzo konkretne konsekwencje prawne.

Dyrektywa 2004/37/WE oraz jej nowelizacje nakładają na pracodawcę obowiązek eliminacji lub zastąpienia czynnika rakotwórczego, jeżeli jest to technicznie możliwe, a jeżeli nie – maksymalnego ograniczenia narażenia w całym procesie pracy.

Te same zasady zostały przeniesione do prawa polskiego. Przepisy wymagają identyfikacji wszystkich miejsc narażenia, oceny ryzyka zawodowego oraz stosowania hierarchii środków ochrony – od eliminacji zagrożenia, przez substytucję, aż po środki techniczne i organizacyjne.

Rozwiązania punktowe nie rozwiązują problemu u źródła.

Dlaczego substytuty długo zawodziły

Historia prób zastąpienia formaliny pokazuje, że wiele rozwiązań nie przyjęło się nie dlatego, że „nie działały”, ale dlatego, że zmieniały punkt odniesienia diagnostyki. Wymagały nowych protokołów, nowych progów interpretacyjnych i nowego języka opisu.

A diagnostyka kliniczna nie toleruje dialektów. Potrzebuje wspólnego języka.

GAF – ewolucja zamiast rewolucji

Rozwiązania oparte na neutralnym, acid-free glioksalu (GAF) nie próbują zmieniać języka patomorfologii. Zachowują aldehydowy mechanizm utrwalania, na którym oparto H&E, IHC, FISH i CISH, jednocześnie ograniczając agresywność chemiczną i zmienność procesu.

W praktyce oznacza to, że laboratorium nie musi zmieniać sposobu barwienia H&E, przebudowywać paneli immunohistochemicznych ani uczyć się nowego obrazu mikroskopowego. Zmienia się nie interpretacja, lecz stabilność punktu wyjścia.

GAF nie eliminuje wszystkich problemów. Jest próbą przesunięcia równowagi w stronę większej przewidywalności preanalitycznej i wolniejszego, bardziej kontrolowanego „starzenia się” utrwalacza.

Stabilność jako warunek

W świecie, w którym coraz więcej decyzji opiera się na subtelnych różnicach sygnału – zarówno morfologicznych, jak i molekularnych – stabilność przestaje być luksusem. Staje się warunkiem.

Najgroźniejsze zmienne w diagnostyce to nie te, które się psują, lecz te, które zmieniają się powoli i w ciszy – dokładnie wtedy, gdy przestajemy na nie patrzeć.