Breaking Bad... Controls. Jak zrobić to dobrze.

Dlaczego „domowa produkcja” kontroli IHC to zły interes — i jak standaryzowane materiały ratują diagnostykę?

W immunohistochemii każdy błąd może mieć realne konsekwencje kliniczne. Nic dziwnego: IHC decyduje o leczeniu, o kwalifikacji do terapii ukierunkowanych, o diagnostyce nowotworów, a także o ocenie ryzyka. A jednak w wielu laboratoriach ciągle królują kontrole in-house — wycinane z bloczków pacjentów, tworzone w postaci macierzy, „kompletowane” z tego, co akurat jest pod ręką. Nikt nie zwraca uwagi, że 50 mikrometrów głębiej nie ma już tego samego immunofenotypu, albo ekspresja jest na zupełnie innym poziomie. Niewielu też zwraca uwagę na to, że kontrola powinna być także użyta w przypadku badań CISH czy FISH. A jeśli już będzie użyta, to ciężko się odnieść do takiej niestandaryzowanej kontroli w tak istotnym badaniu.

Brzmi znajomo?

Domowa produkcja może wyglądać na sprytne i tanie rozwiązanie dla szybkiego osiągnięcie efektów… dopóki nie zacznie się sypać.

1. Kontrole In-House — dlaczego to kontrolowana katastrofa?

1.1 Heterogenność materiału

Jaki jest największy problem? To, że każdy skrawek z tego samego bloczka może wyglądać inaczej. I to dosłownie. Nie możemy być pewni, że kilka wycinków dalej, materiał tkankowy będzie taki sam pod względem immunofenotypu.

Skroisz 20–50 µm głębiej i:

• ekspresja jest inna,

• intensywność spada,

• antygenu już nie ma,

• albo trafiasz w inny typ komórek.

To absolutnie eliminuje możliwość powtarzalności, porównywania serii, stosowania do markerów ilościowych, czy użycia w AI i patologii cyfrowej, które powoli stają się złotym standardem diagnostyki.

1.2 Brak standaryzowanej ekspresji

Materiał tkankowy od pacjenta nie jest „fabrycznie wyrównany”. NIGDY!

Na ekspresję przecież wpływają takie składowe jak:

• choroba podstawowa,

• kondycja tkanki,

• utrwalenie,

• przechowywanie,

• i co najważniejsze, bardzo często przypadek.

  
  

Efekt? Tego nie da się traktować jako rzetelnej kontroli. Jak bowiem użyć takiej kontroli w badaniach FISH czy CISH. Skąd wiadomo, że badanie wyszło bądź nie? Bardzo często w badaniach FISH brakuje w ogóle kontroli pozytywnej i negatywnej, a gdy jest w ogóle wykorzystywana to nie ma żadnej wartości, ponieważ wycinek kontrolny na każdym kolejnym szkiełku będzie dawał zupełnie inny wynik. Czy zatem lepsza jakakolwiek kontrola niż jej brak? Jak zawsze to zależy. W przypadku standardowych markerów dla których migdałek albo wyrostek robaczkowy jest idealnym materiałem kontrolnym, lepiej użyć jakiejkolwiek kontroli niż standaryzowanej. Natomiast dla badań HER-2, PDL-1, czerniaków,  MMR, Receptorów estrogenowych i progesteronowych, czyli wszędzie tam, gdzie na wyniku oparte jest dalsze leczenie używanie jakiejkolwiek kontroli nie jest wcale lepsze od użycia żadnej. Zaskakuje więc fakt, że firmy dostarczające rozwiązania IHC np. na 1000 oznaczeń dostarczają 10 czy 20 szkiełek kontrolnych. Czy to wynik "oszczędności" czy obawy, że może okazać się że system nie jest taki perfekcyjny? O tym odrobinę dalej.

1.3 Koszt, który wszyscy zaniżają (albo ignorują)

Jeśli myślicie że wykonywanie bloczka kontrolnego samemu w labie jest dużo tańsze to jesteście w ogromnym błędzie. Dlaczego?

Koszt obejmuje pracę sekretariatu, który musi znaleźć odpowiednie przypadki, technika, który wybiera bloczki, patologa, który ocenia preparaty i zaznacza fragmenty do użycia, technika wykonującego testy próbne (jeśli są potrzebne), technika przygotowującego macierz czyli wycina puncherem wałeczki, formuje odpowiednio bloczek parafinowy, zatapia, a później oczywiście kroi. Całkiem sporo ludzi i sporo pracy. Największym zaskoczeniem jednak jest to, że wiele jednostek/szpitali głównie zwraca uwagę na to aby koszty działalności były jak najniższe, podczas gdy podnoszą je pozwalając na wykonywanie kontroli chałupniczym sposobem i angażując specjalistów wykonywanie prac innych niż diagnostyka.

Pomijając kwestie związane z personelem istnieje ryzyko, że fragmenty TMA wypadną, że nastąpi błąd podczas zatapiania i pomylimy kolejność, że jeden z fagmentów skończy się nam po kilku cięciach albo że w ogóle zrobimy 70 szkiełek i całą przygodę trzeba zacząć od nowa.

Gdy policzy się realną roboczogodzinę, kontrola in-house okazuje się jedną z najdroższych i najmniej efektywnych form kontroli w IHC (oczywiście nie wspominam tutaj kwestii wybrania jakiegokolwiek fragmentu migdałka i wrzucenia na szkiełko). Realnie, gdy wszystko idzie bardzo gładko cena wyniesie około 1200 zł za 1 bloczek przyjmując średnie wynagrodzenia personelu w szpitalach. To jest 12 zł do każdego wykonanego testu IHC. No właśnie, jeśli idzie gładko... Bo wystarczy, że wyszukany bloczek nie nadaje się do macierzy, że okaże się że zostało niewiele materiału, a już wszyscy muszą spędzić dodatkowy czas. Dwa razy więcej pracy oznacza 2 razy większe koszty. Czy Zakład Patomorfologii stać na to by być "oszczędnym"? Niekoniecznie. Raz, że we wszystkich jednostkach brakuje personelu zarówno technicznego jak i specjalistów, dwa że nie każdy ma dostęp do materiału, kóry można użyć jako bloczki kontrolne. A  zgodnie z wytycznymi kontroli używać trzeba.

1.4 Zmienna jakość skrawków

Bruzdy, fałdy i szarpnięcia — każdy z tych problemów generuje konieczność dokrawania. Domowe macierze mają znacznie wyższą awaryjność niż profesjonalne materiały. Nie nadają się do patologii cyfrowej, jeśli zamierzamy ich używać w celu kalibracji systemów cyfrowych. Systemy AI wymagają jednorodności, powtarzalności i stabilności. In-house nie spełnia żadnego z tych warunków.

Z drugiej jednak strony nie wszyscy inwestują w cyfryzację. Nie oznacza to, że zmienna jakość nie dotyka tych jednostek. Wręcz przeciwnie, zmieniająca się struktura tkankowa zaburza naszą percepcę standaryzacji barwienia. Kiedy będziemy oglądać cały czas taką samą barwę i nagle znajdziemy jakieś odstępstwo, wtedy możemy taki problem wyłapać, czego nie zrobimy, kiedy raz wynik wychodzi mocny, raz słaby a innym razem w ogóle. Skąd bowiem mamy wiedzieć, że tkanka kontrolna od pacjenta nadal ma taką samą ekspresję lub czy w ogóle ją ma? Na pozytywnych, standaryzowanych tkankach kontrolnych wyjdzie zawsze ten sam wynik.

2. Dlaczego standaryzowane, komercyjne kontrole rozwiązują wszystkie te problemy?

Chciałem tu dać przykład o budowie samochodu ale w sumie bliższy każdemu powinien być remont domu czy mieszkania. Taniej będzie kiedy sami zaczniemy malować ściany, prawda? Kupujemy farbę wałek i lecimy. Malujemy pierwszą warstwę, podczas malowania drugiej okazuje się, że poprzednia warstwa przykleja się do wałka. Nie zagruntowaliśmy ścian, więc musimy zedrzeć odpadającą farbę i jedziemy do sklepu po grunt. Gruntujemy i malujemy. Pierwsza warstwa wysycha okazuje się że zabrakło farby, jedziemy kupić kolejną do najbliższego sklepu bo zależy nam na czasie. Malujemy drugą warstwę okazuje się, że odcień nie ten bo inny lot lub nie było dokladnie tej samej nazwy i zamiast "kremowego poranka" kupiliśmy "przyjemny wschód słońca" (nazwy farb nie mają nigdy niczego wspólnego z ich kolorem). Jedziemy do sklepu w którym kupiliśmy pierwszą farbę, a sklep znajduje się na końcu miasta. Oczywiście korki i cała wyprawa zajmuje nam pół dnia. Tak wygląda praca, jeśli nie do końca na niej się znamy. Teraz zapłacimy kilka tysięcy specjaliście, ten przychodzi rozkłada folię, bo zapomnieliśmy w pierwszej kolejności i cała podłoga wymaga zdrapywania farby zresztą jak i okna i inne elementy ktore stały obok, zabezpiecza taśmą okna, miesza grunt z farbą, bierze pistolet i rozpryskuje farbę na ścianie za 5 min cała ściana zagruntowana i pomalowana na biało. W tym wypadku KAŻDY powie, że zapłaciliśmy specjaliście i a tak to by zostało kilka tysięcy w kieszeni. A pomyślmy, że w tym czasie np patolog czy cytolog mógł, zamiast tydzień pracować z wałkiem, oglądać szkła. Nigdy nie zwracamy uwagi na czas, który jest najcenniejszy. Bo oczywiście można było w tym czasie zarobić pieniądze, ale też można było iść na spacer do lasu albo wyjechać na wakacje. To się dzieje w każdym laboratorium, w którym specjalista w danej dziedzinie wykonuje rzeczy, którymi wcześniej się nie zajmował. A wracając do naszej QC.

2.1 Homogeniczność

Profesjonalne kontrole są oparte na stabilnych, powtarzalnych liniach komórkowych lub standaryzowanych materiałach referencyjnych. Oznacza to, że każdy skrawek od pierwszego do ostatniego wygląda identycznie. Coś, czego nie da się uzyskać z macierzy robionej ręcznie.

2.2 Określona, powtarzalna ekspresja antygenu

Kontrole te są projektowane tak, by mieć:

• znany poziom ekspresji,

• stabilność w czasie,

• możliwość odtwarzania serii.

Dlatego nadają się do badań takich jak HER2, PD-L1, MMR, Ki-67, patologii cyfrowej, walidacji ilościowych protokołów.

Można wykonać 450 identycznych skrawków z jednego bloczka (w zależności od producenta). W kontrolach in-house to absolutnie nieosiągalne.

2.3 Minimalizacja ryzyka technicznego

Profesjonalnie przygotowane bloczki są:

• odporne na wypadanie elementów

• idealnie zatopione,

• łatwe w krojeniu,

• przewidywalne.

Wszystkie te elementy są zapewnieniem, że bloczek używany do kontoli będzie miał najwyższą wydajność; nie będzie trzeba go tak często trymować, skrawki nie będą się rozdzierać, a przede wszystkim wszystkie pola komórkowe będą miały tę samą grubość i wystarczą na tę samą ilość badań.

Biorąc te wszystkie argumenty pod uwagę pozostaje jedno zasadnicze pytanie. Kto waliduje same systemy IHC? W wielu jeśli nie w większości laboratoriów kontrola IHC w ogóle nie istnieje, jeśli istnieje jest robiona w sposób uniemożliwiający standaryzację. Wszyscy skupiają się na tym żeby sprawdzić czy w ogóle sprzęt barwi czy nie barwi. Nikt jednak nie skupia się na tym, czy barwi dobrze, czy jest również sprzętem wystandaryzowanym. Kontrola jakości powinna być wykonywana nie tylko dla badań ale także dla urządzeń, którymi wykonujemy badania. Bez sensu? To teraz kij w mrowisko.

3. Problem różnic między stanowiskami w instrumentach automatycznych

Badania wykazały, że w niektórych systemach IHC (np. wielopozycyjnych automatów barwiących) intensywność barwienia może różnić się nawet o kilkadziesiąt procent w zależności od pozycji na urządzeniu.  W jednym z najczęściej używanych systemów różnice sięgały nawet 40% i to w jednym urządzeniu. Wychodzi na to, że zależnie od tego, gdzie połozymy szkiełko pacjent może otrzymać leczenie bądź nie. Teraz należy się zastanowić, czy chcielibyśmy być na miejscu takiego pacjenta.

Co to oznacza?

Bez standaryzowanej kontroli:

• HER2 3+ może wypaść jako 1+,

• PD-L1 50% może wypaść jako 10%,

• MMR może wyglądać na utracony, choć nie jest,

• pacjent może dostać złe leczenie — lub nie dostać potrzebnego.

To nie detal techniczny. To poważny problem kliniczny, który powinien być weryfikowany każdorazowo.

3.1. Dlaczego różnice między stanowiskami naprawdę są problemem?

Visiopharm i twarde dane zamiast „wygląda OK”

W diagnostyce IHC przez lata wiele laboratoriów polegało na ocenie wizualnej — ludzkim oku, doświadczeniu patologa i porównywaniu „na zdrowy rozsądek”.

Problem w tym, że ludzkie oko nie wykryje subtelnych różnic intensywności barwienia, a barwienia ilościowe (HER2, PD-L1, Ki-67, MMR i inne) nie wybaczają nawet 10% odchyleń, nie mówiąc o 30–40%.

Właśnie dlatego warto przywołać systemy takie jak Qualitopix— platformę analityczną, która wykorzystuje:

• algorytmy komputerowej analizy obrazu,

• segmentację komórkową opartą na AI,

• pomiary intensywności barwienia oparte na fotometrii, czy

• walidowane modele oceny markerów ilościowych.

To nie jest „ocena na fartuch”. To laboratoryjna fotometria cyfrowa, która mierzy każdy piksel, każde jądro, każdą intensywność DAB.

W jednym z testów porównawczych na UMC w Utrechcie, gdzie oceniano wydajność różnych pozycji w automacie IHC wspomnianym wcześniej, to Visiopharm wykazał różnice intensywności barwienia, mimo użycia tego samego szkiełka kontrolnego, barwionego w tej samej serii, na tej samej platformie. Wystarczy podkreslić, że wspomniany system IHC został zaimplementowany lata temu i przez lata wydawania wyników nikt nie zwrócił uwagi, że byćmoże coś jest nie tak. A co gdybyśmy jednak mieli standaryzowane kontrole? Co gdybyśmy używali sztucznej inteligencji do oceny jakości wydawanych wyników? Nie mielibyśmy wątpliwości czy wynik wydany np 5 lat temu wykonany na systemie X nie wykluczył pacjenta z leczenia, które by uratowało mu życie.

W dużym skrócie oznacza to, że kontrola in-house, która sama jest zmienna, nie ma szans wykryć różnic aparaturowych. Dopiero standaryzowana, jednorodna kontrola pozwala zobaczyć, czy to instrument zaniża, zawyża lub zaburza intensywność.

3.2. Co z tego wynika?

Bez stabilnej kontroli:

• algorytm nie ma punktu odniesienia,

• różnice pozycyjne nie są wykrywane,

• laboratoryjne odchylenia mogą wyglądać jak „prawidłowe barwienia”,

• wyniki ilościowe są nieporównywalne,

• ryzyko błędnej kwalifikacji pacjenta realnie i znacząco rośnie.

Qualitopix udowadnił liczbowo to, czego nie widać gołym okiem. Ale żeby coś udowodnić, trzeba mieć punkt odniesienia — a tę rolę może pełnić wyłącznie materiał kontrolny o stałej, znanej i jednorodnej ekspresji.

4. Nowe panele, które „rozpalą” diagnostykę

Profesjonalne systemy kontroli coraz częściej obejmują:

1. panele MMR (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) — kluczowe w diagnostyce raka jelita i MSI, czy

2. panele melanocytarne — przydatne w diagnostyce czerniaków i zmian trudnych.

To kierunek, w którym idzie cała światowa diagnostyka.

Podsumowanie: czas przestać „gotować” kontrole w piwnicy

IHC w 2025 roku wymaga stabilności, powtarzalności, ilościowej porównywalności, spójności między seriami, odporności na różnice aparaturowe. Kontrole in-house nie spełniają tych wymogów. Stanowią ryzyko — organizacyjne, techniczne, kliniczne i zapewnie prawne jakby się temu nie przyjrzeć.

Nowoczesne, standaryzowane kontrole i systemy kontroli jakości rozwiązują wszystkie te problemy w jednym ruchu. Dają pewność wyników, bezpieczeństwo pacjenta i powtarzalność, która dziś jest koniecznością, a nie luksusem. Zachęcam do kontaku i dyskusji na ten temat.