Nie taki H. pylori straszny jak go malują

Barwienie Giemzy dla oznaczenia bakterii Helicobacter pylori jest jednym z najistotniejszych barwień w gastroenterologii. Pomaga w ocenie przyczyny zmian zachodzących w żołądku czy w dwunastnicy. O ile barwienie samo w sobie dla doświadczonego patologa nie jest problematyczne, o tyle ze względu na swoją monochromatyczność może młodych diagnostów doprowadzić do białej gorączki. Coraz częściej sięga się po oznaczenie immunohistochemiczne, które dzięki DAB+ oznacza bakterie na brązowo. Jednakże w porównaniu z histochemiczymi metodami jest ono nieporównywalnie droższe.

Dzisiaj po bardzo długim czasie postanowiłem napisać o metodyce tego barwienia, gdyż w ostatnim intensywnym czasie pełnym szkoleń w przeróżnych laboratoriach zauważyłem, że z pozoru bardzo proste barwienie może przyprawiać techników i diagnostów o ból głowy, a niestety nie wszyscy wiedzą że monochromatyczne barwienie Giemzy wynika najczęściej z trzymania się stricte wytycznych opisanych przez dostawców, którzy nie mają do czynienia z technikami w patologii wcale albo ich pojęcie jest znikome. Nie dość, że z prostego barwienia możemy zrobić wielokolorowy obraz biopsji żołądka czy dwunastnicy, to jeszcze mamy kilka barwień, które znacznie mogą usprawnić nam ocenę H. pylori.

Zacznę dzisiaj od metody, która nie jest zbyt popularna, głównie ze względu na żółcień alcjańską, która przez długi czas była bardzo droga i mało dostępna, niemniej jednak dziś barwienie to jest znacznie tańsze i wygodniejsze (kat. 010269, DiaPath). Zresztą zobaczcie sami:

Metoda została zaproponowana przez J. K. Leung i K. Gibbon’s w 1998 roku i do dziś jest metodą najbardziej usprawniającą ocenę H. pylori. Wiele modyfikacji barwienia metodą Giemzy wytwarzanych przez różnych producentów bazuje na metodzie Leung & Gibbon’s.

Aby wykonać oryginalne barwienie potrzebujemy 4 odczynników bazowych:

• kwasu nadjodowego 1%

• dwusiarczanu sodu 5%

• żółcieni alcjanu 1%

• błękitu toluidyny 1%

Metodyka:

1. Sekcje najpierw musimy odparafinować i uwodnić

2. Utlenić w kwasie nadjodowym 1% przez 10 min.

3. Dobrze wypłukać w wodzie

4. Zredukować w dwusiarczanie sodu 5% przez 5 min

5. Płukać w wodzie

6. Barwić żółcienią alcjanu przez 5 min

7. Nadmiar barwnika dobrze wypłukać w wodzie

8. Barwić świeżo przygotowanym błękitem toluidyny przez 3 min.

9. Nadmiar barwnika wypłukać w wodzie.

10. Wysuszyć.

11. Bardzo szybko odwodnić, sklarować i zakleić.

Dla odwodnienia możemy stosować mieszaninę ksylen / aceton w rosnącym stosunku dla ksylenu:

(Ksylen) 1: 3 (Aceton)

(Ksylen) 1: 1 (Aceton)

(Ksylen) 3: 1 (Aceton)

Świeżo przygotowany błękit toluidyny zapewni nam czysty roztwór bez dodatkowych bakterii, które mogłyby przyczyniać się do wyników fałszywie pozytywnych. Niektóre odczynniki oferowane przez producentów (kat. C0142, DiaPath) zawierają substancje nie pozwalające na przeżycie grzybów i bakterii, dzięki czemu także mogą się nadawać do użycia, bez przygotowywania odczynników na bieżąco.

Drugim barwieniem, o którym warto wspomnieć jako ciekawostkę, aczkolwiek praktycznie nie używanym jest barwienie wg metody dr Sadie Sayeed. W tej metodzie używa się odczynnika Schiff’a w celu wybarwienia śluzu dla kolor malinowy. Niemniej jednak odczynnik Schiff’a jest bardzo czuły na zmiany temperatur, rodzaj używanej wody itd. i bardzo szybko potrafi tracić swoje zdolności barwiące zmieniając barwę preparatu z malinowego na purpurowy, co przy niebieskim kolorze po zabarwieniem błękitem metylenowym daje dość nieatrakcyjne zróżnicowanie struktur.

Kolejnym barwieniem, które możemy stosować w ocenie H. pylori jest barwienie GENTA (kat. 1660, Morphisto GmbH). Barwienie zupełnie różne od wszystkich dostępnych na rynku, głównie dlatego, że tło jest pomarańczowo-czerwone, natomiast bakterie szaro-czarne.

Do barwienia używamy m.in. mastyksu, azotanu srebra w różnych stężeniach, hematoksyliny Gilla III, błękitu alcjanu czy hydrochinonu. Zanim zaczniemy barwienie, musimy przygotować roztwory bazowe po czym możemy zabrać się do istoty sprawy. Całą część barwienia należy wykonywać w temperaturze 45-60 st C, a resztę w temperaturze pokojowej. Nie możemy też tak sobie po prostu włożyć szkiełek do płuczek Coplina czy Hallendahla, musimy najpierw ww. płuczkę ogrzać do temperatury 45 st C. Z całkiem dobrych wieści, o ile oryginalne barwienie trwa 1,5 godziny, o tyle modyfikacja już 0.5 h (oczywiście pomijając przygotowanie).

Barwienie z punktu widzenia diagnostyki jest bardzo efektywne i bardzo ułatwia diagnostykę, niemniej jednak z punktu widzenia techniki jest bardzo wymagające. Zainteresowanych zapraszam do zapoznania się z publikacją na temat barwienia, której tytuł zamieszczam na końcu.

Wisienką na torcie jest standardowe barwienie Giemzy. Najczęstszy kolor wybarwionych preparatów jakie spotykamy to kolor niebieski. Ewentualnie ciemno-niebieski. Jednak dobierając odpowiednia czasy płukania w fazie odwadniania możemy nadać tkance bardzo ciekawą kolorystykę. Barwnik Giemzy w końcu nie jest jednoskładnikowym odczynnikiem. To rozpuszczony błękit metylenowy i eozyna y w alkoholu. Jeśli zdamy sobie z tego sprawę, od razu wiemy, że kolorystyka którą możemy uzyskać mieści się w zakresie od różowego, poprzez fioletowy po granatowy właśnie. Dobierając odpowiednią długość płukania w 70% alkoholu po barwieniu, możemy osiągać pełne zróżnicowanie kolorystyczne.

Dlaczego nie podaję żadnego konkretnego czasu? Dlatego, że nie zależy to jedynie od czasu, a od tego kto jest producentem odczynnika Giemzy (jakie dokładnie jest stężenie eozyny), jak twardą wodę macie pod ręką, jakiego stężenia alkoholu etylowego używacie. Jedno jest pewne, trzymanie preparatów zbyt długo w alkoholu etylowym ujednolici barwę, co będzie dawało nam granatowy efekt.

Poniżej możecie zobaczyć, jak wygląda dobrze zróżnicowane barwienie metodą Giemzy.

Następnym razem, gdy będziecie barwić metodą Giemzy, pamiętajcie o tym zdjęciu, aby celem było osiągnięcie tego poziomu. Jeśli już Wam się udaje uzyskiwać taki efekt w waszym laboratorium to wielkie gratulacje!

Inne barwienia H. Pylori nie wymienione w powyższym tekście, ale które warto sprawdzić:

Barwienie Warthin-Starry (szybsza metoda z azotanem srebra, bardzo popularna)

Barwienie Field'a (głównie w celu wykrywania zarodźców malarii, ale przy bardzo cienkich wycinkach 2-3 mikrometry, pasuje również dla H. pylori)

Błękit toluidynowy (10-minutowe barwienie)

Bibliografia:

1. el-Zimaity, Hala & Wu, J & Graham, DY. (1999). Modified Genta triple stain for identifying Helicobacter pylori. Journal of clinical pathology. 52. 693-4. 10.1136/jcp.52.9.693.

2. Laine L, Lewin DN, Naritoku W, Cohen H. Prospective comparison of H&E, Giemsa, and Genta stains for the diagnosis of Helicobacter pylori. Gastrointest Endosc. 1997 Jun;45(6):463-7. doi: 10.1016/s0016-5107(97)70174-3. PMID: 9199901.

3. Leung, K., & Gibbon, K.J., (1996) A rapid staining method for Helicobacter pylori in gastric biopsies Journal of Histotechnology, v. 19, pp. 131