Alchemia impregnacji

Srebro jest najczęściej używanym metalem do impregnacji struktur tkankowych, ale bynajmniej nie jest jedynym. Chociaż stosunkowo rzadko, złota możemy także używać do wykrywania substancji takich jak amyloid lub oznaczania astrocytów za pomocą sublimatu złota Cajala (złoto i chlorek rtęci).

Nie wszyscy oczywiście postrzegają metody osadzania metali innych niż srebro lub złoto jako impregnację samą w sobie. W pewnym stopniu zależy to od tego, co stanowi „impregnację” i jak ją definiujemy. Termin ten interpretowany jest dość szeroko i obejmowałby prawie każdą metodę, w której metal jest w jakikolwiek sposób selektywnie przytwierdzany do dowolnej struktury tkanki, a następnie w jakiś sposób uwidaczniany. Obejmuje to takie związki, jak tetratlenek osmu dla triglicerydów, miedź dla kwasów tłuszczowych i zarówno metody koloidalnego żelaza dla kwaśnych mukopolisacharydów, jak i metoda redukcji żelazocyjanku Schmorla dla melaniny i enterochromafiny. Wszystkie te techniki osadzania metalu następnie demonstrują go fizycznie lub chemicznie.

Chociaż jony metali używane są również do tworzenia barwników, są one zasadniczo albo nośnikami barwnika, albo po prostu łączą się z nim i zmieniają jego kolor. Główny nacisk nadal kładzie się na barwnik, więc są one postrzegane jako odmiana barwienia. W impregnacji to sam metal lub jedna z jego nierozpuszczalnych soli tworzy końcowy widoczny składnik, czyli cała uwaga skupia się na metalu.

Srebro

Impregnacja jonami srebra jest dość dobrze poznana jako metodyka i dziś nie będę się na niej skupiał. Choć jestem prawie pewny, że pojęcia takie jak "argentaffin" czy "argyrofile" mogą zastanowić, dlatego odniosę się do nich kiedy indziej, gdy przyjdzie pora na opracowanie tej metodyki.

Impregnacja srebrem - Diapath.com

Złoto

Impregnacje złotem nie są rozumiane lepiej niż impregnacje srebrem. Zostały opracowane empirycznie i tak pozostają odbierane. Zwykle wymagane jest doświadczenie i znajomość technik.

Impregnacja srebrem jak i złotem są starszymi technikami barwienia, które były powszechnie stosowane przed laty. Szczególnie impregnacja złotem używana jest do dziś okazjonalnie do obserwacji szczegółowych struktur i procesów biologicznych, takich jak połączenia międzykomórkowe czy procesy komórek nerwowych. W zależności od zastosowanej metody i materiału srebro/złoto) efekt końcowy może być brązowy, złoty lub czarny.

Proliferation of reactive astrocytes. Cajal Gold sublimate. (1)

Osm

Osmacja lipidów jest dość dobrze poznana. Czterotlenek osmu rozpuszcza się w lipidach lub reaguje z nimi chemicznie, w zależności od rodzaju lipidu. Podczas odwadniania osm rozpuszczony w lipidach jest redukowany do innego związku osmu, prawdopodobnie niższego tlenku. Podczas pracy z rozpuszczalnikami, takimi jak ksylen, lipidy są rozpuszczane, pozostawiając czarny osad osmu w miejscu, w którym kiedyś one się znajdowały. Te lipidy, które reagują chemicznie z tetratlenkiem osmu, są utrwalone i nie mają na nie wpływu żadne odczynniki chemiczne. Pozostają w tkance przepojonej parafiną i są czernione przez reakcje z czterotlenkiem osmu, który je jednocześnie utrwala. Oba procesy zachodzą w tym samym czasie, więc w obu przypadkach obecność lipidów objawia się czarnymi złogami osmu.

Niestety tetratlenek osmu ma dwie bardzo poważne wady. Jest dość toksyczny i bardzo drogi. Z tych powodów zwykle używa się go tylko w sytuacjach, w których sekcje mrożone są niemożliwe do wykonania w celu barwienia Sudanem. Trzeba pamiętać, że jest to tak naprawdę jedyny utrwalacz, umożliwiający zachowanie lipidów w trakcie procesu infiltracji parafiną, chociaż ma również znaczenie dla utrwalania błon lipidowych i struktur, takich jak mitochondria.

Tetratlenek jest drogi i toksyczny… ale i kapryśny. Jest to utrwalacz, który infiltruje tkankę bardzo powoli. Do tego stopnia, że utrwalając wierzchnie warstwy wycinka tkankowego, sam sobie zamyka drogę do dalszej penetracji, dlatego najczęściej wymagane jest pobieranie bardzo cienkich wycinków, a w miarę możliwości i małych, aby cała tkanka mogła zostać dobrze przepojona. Z reguły dobra infiltracja tkanki o grubości 2mm trwa około 24 godzin. Nie ma znaczenia, czy włożymy tkankę do cieplarki, ponieważ to wina ciężkiego tetratlenku osmu. Dlatego właśnie, dla zachowania lepszej struktury tkanki samej w sobie lepiej przeprowadzać cały proces w lodówce.

W jaki sposób tetratlenek osmu dziala?

Według Profesora Baker’a prawdopodobnie łączy białka poprzez łańcuchy boczne tryptofanu i histydyny, i prawdopodobnie blokuje grupy aminowe, ponieważ barwienie barwnikami kwasowymi jest później mocno utrudnione. Wydaje się, że nie ma żadnego wpływu na DNA. Węglowodany są w dużej mierze też są nienaruszone.

1. Po utrwaleniu w buforowanej formalinie przez co najmniej 24 godziny, należy wypłukać cienkie wycinki tkanki przez noc pod bieżącą wodą, aby usunąć wszelkie ślady utrwalacza.

2. Wypłukaną tkankę należy przepłukać w kilku zmianach wody destylowanej przez godzinę lub dłużej.

3. Umieść tkankę w 0,5% tetratlenku osmu rozpuszczonym w wodzie destylowanej na 24 godziny.

4. Należy wypłukać fragment tkankowy w kilku zmianach wody destylowanej przez godzinę lub dłużej, aby usunąć nadmiar tetratlenku osmu.

5. Aby być pewnym usunięcia roztworu, należy płukać przez noc pod bieżącą wodą.

6. Dalej możemy już włożyć wycinek do kasetki i przeprowadzić pełny proces do infiltracji parafiną lub wrzuć jeszcze na jakiś czas do formaliny. Trzeba pamietać, że formalina zredukuje tetratlenek osmu w tkance i sprawi, że będzie ona czarna.

Na skrawkach parafinowych bez barwienia wszystkie lipidy będą miały kolor czarny lub szary, w tym trójglicerydy i lipoproteiny.

Gruczoł sutkowy jednocześnie syntetyzuje kilka różnych substancji, które są uwalniane do pęcherzyków. W okresach laktacji komórki wydzielnicze wytwarzają kropelki tłuszczu. Łączą się w większe kropelki i są przenoszone do regionu komórek szczytowych. W końcu stają się częścią formacji pęcherzykowych w plazmalemmie i są ściskane jako kropelki mleka. (2)

Miedź

Metoda miedziowa dla kwasów tłuszczowych jest reakcją chemiczną. Miedź tworzy sól z kwasem tłuszczowym i można ją następnie oznakować metodami dla miedzi takimi jak metoda z kwasem rubeanowym wg Howella. Metoda wysalania kwasów tłuszczowych nie jest dziś popularna, głównie ze względu na czas jaki jest potrzebny do przeprowadzenia reakcji w utrwalonej tkance. Natomiast sama metodyka barwienia miedzi wg Howell’a już jak najbardziej:

Metodyka

Odpowiednie są 5 µl skrawki parafinowe tkanki utrwalonej w obojętnej

buforowanej formalinie. Inne utrwalacze są zadowalające.

1. Doprowadzić skrawki do wody za pomocą ksylenu i etanolu.

2. Umieścić w roboczym roztworze kwasu rubeanowego na noc w 37°C.

3. Umieść w 70% etanolu na 15 minut.

4. Umieścić w absolutnym etanolu na 6 godzin.

5. Lekko zabarwić eozyną alkoholową jako kontrbarwienie.

6. Dobrze spłukać absolutnym etanolem.

7. Oczyścić ksylenem i zamontować na podłożu żywicznym.

Oczekiwane rezultaty:

Miedź – czerwono-czarne granulki

Cytoplazma – różowy

Uwagi

• Należy stosować zarówno kontrolę negatywną, jak i pozytywną, ponieważ sporadycznie zdarzają się nieprawidłowości w barwieniu. Odpowiednią kontrolą pozytywną jest wycinek wątroby ze znanego przypadku choroby Wilsona. W przeciwnym razie miedź można znaleźć w wątrobie z przewlekłego aktywnego zapalenia wątroby.

• Miedź tworzy chelat z kwasem rubeanowym, podobnie jak niektóre inne metale. Spośród nich kobalt i nikiel można pomylić z miedzią, dlatego do roztworu dodaje się octan sodu w celu ich zahamowania.

• Kwas rubeanowy jest również znany jako etanoditioamid, ditiooksaamid lub ditiooksalinowy diamid.

Czerwonawo-brązowe zabarwienie złogów miedzianych ziarnistości są widoczne głównie w hepatocytach sąsiadujących z kanalikami żółciowymi i są głównie okołojądrowe.(3)

Żelazo

Technika koloidalnego żelaza dla kwaśnych mukopolisacharydów jest podobna, żelazo reaguje chemicznie z „kwaśnym” składnikiem kwaśnych mukopolisacharydów, a następnie można oznaczyć za pomocą błękitu pruskiego Perls’a, standardowej metody dla żelaza. W metodzie Schmorl’a z kolei roztwór jest mieszaniną żelazocyjanku potasu i chlorku żelazowego, które ze sobą nie reagują. Substancja redukująca redukuje żelazocyjanek [Fe(CN)6]^3− do żelazocyjanku [Fe(CN)6]^4− . Reaguje on natychmiast z chlorkiem żelazowym, tworząc błękit pruski, który jest nierozpuszczalny i natychmiast wytrąca się w miejscu powstawania, gdzie znajdował się czynnik redukujący.

Zarówno metoda Perls’a jak i Schmorl’a są bardzo powszechne na dzień dzisiejszy w wykrywaniu niektórych nowotwoów, chorób neurodegeneracyjnych czy przewlekłych chorobach wątroby.

Barwienie wg Perls'a wykazujące złogi hemosyderyny w komórkach kanalika proksymalnego – „niebieska nerka” (4)

Barwienie wg Schmorl'a (5)

Kwestia czy coś jest impregnacją czy też nie, jak już wspomniałem na samym początku jest zupełnie względna. Ze względu na fakt, że składową wielu barwników są jony metali można by pokusić się o stwierdzenie, że wszystkie barwienia to impregnacja. Przecież w większości metod, nawet w H&E przemycamy jony żelaza czy glinu aby pokazały nam odpowiednią barwę zasadolubnych elementów komórki. Wykrywanie natomiast jonów metali w komórce nie jest niczym innym jak zwyczajnym ich barwieniem czy ekspozycją. Czy zatem powinniśmy mówić na H&E „Impregnacja hematoksyliną, barwienie eozyną”?

Źródła:

1. Liberski, Pawel. (2013). Kuru: A Journey Back in Time from Papua New Guinea to the Neanderthals’ Extinction. Pathogens (Basel, Switzerland). 2. 472-505.

2. Kuehnel, Color Atlas of Cytology, Histology, and Microscopic Anatomy, 4th ed. 2003.

3. 10.Liver (5) Wilson's disease|Pathology Core Pictures

4. Asim, Muhammad & Iqbal, Zafar & Mujeeb, Imaad. (2009). Blue kidney in a pale patient--a case for a causal association between renal haemosiderosis in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria and chronic kidney disease. Clinical Kidney Journal. 2. 365-367.

5. Schmorl Melanin Stain Histology Staining Procedure (newcomersupply.com)

6. Baker, John R., (1958) Principles of biological microtechnique Methuen, London, UK.

7. Kiernan, J.A., (1999) Histological and histochemical methods, theory and practice. Ed. 3, Butterworth, Heinemann, Oxford, UK.

8. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Edition (0702042269)

9. DiaPath Perl's stain kit documentation: Perls kit | 010236 | Diapath

10. DiaPath Silver Impregnation kit documentation: Silver Impregnation Stain | Diapath