What was and is not... / Co było a nie jest...

When we perform staining and adhere to procedures or their proven modifications, most often there are no problems with evaluation. However, there are melanocytic lesions in which there is so much melanin that it is impossible to diagnose the preparation. For immunohistochemical staining, it is absolutely inadvisable that the brown color should come from anything other than diaminobenzidine (DAB). What methods to use and what to use to enjoy a clear picture when assessing the above-mentioned changes?

One of the best known and the oldest methods is the use of hydrogen peroxide and PBS. There is not much philosophy here. Prepare 45 ml of fresh PBS and add 5 ml of hydrogen peroxide to it. Place the dewaxed preparation in the solution and voila. The method is simple but quite long as it takes a minimum of one hour (depending on the amount of melanin in the cells).

What if we need to prepare a CITO slide (Cito comese from latin word - fast)? One quicker method is to use formic acid as the reducing agent and then add permanganic acid as the oxidant. The method is faster, but works mostly on very thin sections. However, I personally prefer to use sulfuric acid over formic acid. It is a stronger reducer, and thus accelerates the leaching of melanin from the tissues. During decolorization, we can literally see melanin floating on the surface of the dropped solution.

A big curiosity that I would like to present here is the Schmorl's dyeing. We need to prepare a reagent for it Schmorl's, which consists of:

• Potassium cyano ferrate

• Iron chloride

• Water

For those willing, I recommend looking for a specific reagent preparation method.

However, it is not a rinsing out of melanin, but only a replacement for its quite bothersome color. Fast Red is used as counterstaining. Thanks to this staining, we are able to expose the cell nuclei in red, and turn brown melanin to blue.

Do you have any proven method for melanin?

Source:

1. Bloch, B., 1917. Des Problem Pigmentbildung in der Haut. Archives Dermato-Syphiligraphiques 124, 129.

2. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Edition

3. Herschberger, L.R., Lillie, R.D., 1947. Physical properties of acid formalin hematin, or formalin pigment. Journal of Technical Methods and Bulletin of the International Association of Medical Museums 27, 162.

4. Orchard, G. E., 1999. Heavily pigmented melanocytic neoplasms: comparison of two melanin-bleaching techniques and subsequent immunohistochemical staining. British Journal of Biomedical Science 56, 188–193.

5. Manicam C, Pitz S, Brochhausen C, Grus FH, Pfeiffer N, et al. (2014) Effective Melanin Depigmentation of Human and Murine Ocular Tissues: An Improved Method for Paraffin and Frozen Sections. PLOS ONE 9(7)

------------------------------------------

Kiedy wykonujemy barwienia i stosujemy się do procedur lub ich sprawdzonych modyfikacji, najczęściej nie ma problemów z oceną. Zdarzają się jednak zmiany melanocytarne, w których barwnika jest tak dużo, że uniemożliwia wręcz diagnostykę preparatu. W przypadku barwień immunohistochemicznych absolutnie niewskazane jest aby, brązowy kolor pochodził od czegoś innego niż di-aminobenzydyny (DAB). Jakich metod używać i co stosować aby móc się cieszyć czystym obrazem podczas oceny ww. zmian?

Jedną z bardziej znanych metod jest użycie wody utlenionej i PBS-u. Nie ma tu zbyt wielkiej filozofii. Należy przygotować 45 ml świeżego PBS-u i dodać do niego 5ml wody utlenionej. Odparafinowany preparat umieszczamy w przygotowanym roztworze i voila. Metoda jest prosta, ale dość długa, ponieważ zajmuje minimum jedną godzinę (w zależności od ilości melaniny w komórkach).

A co jeśli musimy przygotować preparat na CITO (słowo to pochodzi z łaciny i oznacza "szybko")? Jedną z szybszych metod jest użycie kwasu mrówkowego jako reduktora, a następnie dodaniu kwasu nadmanganianowego jako utleniacza. Metoda jest szybsza, niemniej jednak działa głównie na bardzo cienkich skrawkach. Osobiście jednak preferuję używanie kwasu siarkowego zamiast mrówkowego. Jest mocniejszym reduktorem, a co za tym idzie przyspiesza wypłukiwanie melaniny z tkanek. Podczas odbarwiania dosłownie możemy zobaczyć unoszącą się melaninę na powierzchni nakroplonego roztworu.

Dużą ciekawostką, którą chciałbym tutaj przedstawic, jest barwienie Schmorl’a. Przygotować do niego należy odczynnik Schmorl’a, na który składa się:

• Cyjano-żelazian potasu

• Chlorek żelaza

• Woda

Dla chętnych polecam poszukać sposobu wykonania odczynnika.

Nie jest to jednak wypłukiwanie melaniny, a jedynie zastąpienie jej, dość uprzykrzającego ocenę, koloru. Jako kontrbarwienia używany jest Fast Red czyli nuklearna czerwień trwała. Dzięki temu barwieniu, jesteśmy w stanie wyeksponować jądra komórkowe w kolorze czerwonym, natomiast brązową melaninę zmienić na kolor niebieski.

Posiadacie jakiś sprawdzony sposób na melaninę?

Źródła:

1. Bloch, B., 1917. Des Problem Pigmentbildung in der Haut. Archives Dermato-Syphiligraphiques 124, 129.

2. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Edition

3. Herschberger, L.R., Lillie, R.D., 1947. Physical properties of acid formalin hematin, or formalin pigment. Journal of Technical Methods and Bulletin of the International Association of Medical Museums 27, 162.

4. Orchard, G. E., 1999. Heavily pigmented melanocytic neoplasms: comparison of two melanin-bleaching techniques and subsequent immunohistochemical staining. British Journal of Biomedical Science 56, 188–193.

5. Manicam C, Pitz S, Brochhausen C, Grus FH, Pfeiffer N, et al. (2014) Effective Melanin Depigmentation of Human and Murine Ocular Tissues: An Improved Method for Paraffin and Frozen Sections. PLOS ONE 9(7)