We love Sudan / Kochamy Sudan
- Paweł Piotrowski
- Mar 15, 2021
- 5 min read
(Oil Red O is called Sudan Red as well)
Most of the stainings performed in pathology departments concern paraffin blocks previously fixed in formalin. However, not everything can be arranged in this way. Infiltration with further reagents often results in rinsing out some of the components of the cells. Fats are such a component. So how do you stain the fats? You have to take it cool in the first place. Literally, as fat staining is best done on frozen sections. Nevertheless, there are cases where for diagnosis we need to assess the persistent lipids despite the use of solvents in the process. Such lipids will be, among teh others lipofuchsins or myelin residues.
Turns out you have to use the frozen sections, but you don't. It's all about what do You want to look for.
Oil Red O stain (DiaPath.com)
For staining, we will need:
• X working solution
Oil red O (we can also use Sudan III, Sudan IV, Sudan black B) - 1g
Propylene glycol - 100ml
The whole thing should be boiled to a temperature of about 100 degrees C and stirred until saturated. Then filter the solution, preferably with filter paper. The solution must then be cooled to room temperature and filtered again. This time you will need a vacuum pump, due to the density of the solution.
• Hematoxylin according to Mayer or Gill
• 85% propylene glycol (glycol 85 ml + water 15 ml)
Method:
1. Place the paraffin or frozen sections on the slides. They should be cut even to a thickness of 10 µm
2. Place them in propylene glycol for 1-2 minutes
3. Working solution X - 10 min
4. Propylene glycol 85% - 2-3 min, until the slide is rinsed
5. Propylene glycol 85% - 1-2 min
6. Gently stir in tap water at room temperature, changing it several times
7. Counterstain with Mayer or Gill Hematoxylin - 1-2 min
8. Tap water until it turns blue
9. Cover using a WATER based medium
Lipids are red (unless you have used one of Sudan, they can be orange or black)
Cell nuclei - blue
Some advices. Staining is quite difficult to perform and any comments associated with it should be followed. For example:
- Various sources provide information on the fixation of frozen sections, but they can be fixed in formalin for about 30 seconds. (put section on a slide and then into formalin, next rinse in water)
- In the case of paraffin sections, point 3 should be extended to an hour or more.
- Of course, in paraffin sections, most of the fats will be washed out as they pass through the solvents. If any remain, only the ones I mentioned earlier.
- When using Sudan black B, Fast Nuclear Red will be a much better counterstaining, as the blue color of the nuclei may merge with the navy blue / black color of the lipids.
I hope you will find the above description useful. Of course, the whole thing will end up in the knowledge center being created on labpathexperts.com, where you will be able to return to the description at any time.
Follow us on Facebook, Instagram and LinkedIn to stay up to date.
Sources:
1. Filipe, M.I., Lake, B.D. (Eds.), 1983. Histochemistry in pathology. Churchill Livingstone, Edinburgh.
2. Oil Red O DiaPath Data Sheet
3. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Edition
4. Culling C.F.A., (1974) Handbook of histopathological and histochemical techniques Ed. 3 Butterworth, London, UK.
------------------------------------------------
(Oil Red O inaczej jest nazywana Sudan Red)
Większość barwień jakie są wykonywane w zakładach patologii dotyczą bloczków parafinowych, uprzednio utrwalonych w formalinie. Nie wszystko jednak uda się załatwić w ten właśnie sposób. Przepajanie kolejnymi odczynnikami powoduje niejednokrotnie wypłukiwanie niektórych składowych komórek. Taką składową są tłuszcze. W jaki sposób zatem zabarwić tłuszcze? Trzeba wziąć to przede wszystkim na chłodno. I to dosłownie, ponieważ barwienie tłuszczy najlepiej wykonać na sekcjach mrożonych. Niemniej jednak, bywają przypadki, że do diagnostyki potrzebna jest nam ocena lipidów przetrwałych w tkance pomimo używania rozpuszczalników w procesie. Takimi lipidami będą m.in. lipofuksyny czy pozostałości mieliny.
Wychodzi na to, że trzeba używać sekcji mrożonych, ale jednak nie trzeba. Wszystko kwestia tego, czego chcemy szukać, a więc do barwienia.
Oil Red O stain (DiaPath.com)
Do barwienia będziemy potrzebowali:
Roztwór roboczy X
Oil red O (możemy użyć też Sudan III, Sudan IV, Sudan black B) - 1g
Glikol propylenowy – 100ml
Calośc należy zagotować do temperatury około 100 st C i mieszać aż do nasycenia. Następnie należy roztwór przefiltrować, najlepiej bibułą filtracyjną. Następnie roztwór trzeba schłodzić do temperatury pokojowej i przefiltrować ponownie. Tym razem będzie do tego potrzebna pompka ze względu na gęstość roztworu.
Hematoksylina wg Mayer’a albo Gill’a
85% glikol propylenowy (glikol 85 ml + woda 15 ml)
Metoda:
1. Sekcje parafinowe lub mrożone umieszczamy na szkiełkach podstawowych. Powinny być skrojone nawet na grubość 10 µm
2. Umieszczamy je w glikolu propylenowym na 1-2 minuty
3. Roztwór roboczy X – 10 min
4. Glikol propylenowy 85% - 2-3 min, aż do wypłukania podłoża szkiełka
5. Glikol propylenowy 85% – 1-2 min
6. Delikatnie mieszamy w wodzie kranowej, w temperaturze pokojowej, zmieniając ją kilka razy
7. Podbarwiamy Hematoksyliną wg Mayer’a albo Gill'a – 1-2 min
8. Bieżąca woda, aż do zniebieszczenia
9. Zaklejamy używając WODNEGO medium
Lipidy są koloru czerwonego (chyba, że używaliście któregoś Sudanu to mogą być pomarańczowe albo czarne)
Jądra komórkowe – niebieskie
Kilka uwag. Barwienie jest dość trudne w wykonaniu i należy stosować się do wszelkich uwag związanych z nim. Np.
- Bardzo różnie źródła podają informacje odnośnie utrwalania sekcji mrożonych, ale można je utrwalać w formalinie przez około 30 sek. (nanosimy na szkiełko i wkładamy do formaliny, później płuczemy w wodzie)
- W przypadku sekcji parafinowych punkt 3 należy wydłużyć do godziny albo i dłużej.
- Oczywiście w sekcjach parafinowych tłuszcze w większości się wypłuczą podczas przeprowadzania przez kolejne odczynniki. Jeśli jakiekolwiek pozostaną to tylko te, o których wspomniałem wcześniej.
- Używając Sudan black B, zdecydowanie lepszym kontrbarwieniem będzie Czerwień Jądrowa, gdyż niebieski kolor jąder może się zlewać z granatowym / czarnym kolorem lipidów.
Mam nadzieję, że powyższy opis wam się przyda. Całość wyląduje oczywiście w tworzonej bazie wiedzy na labpathexperts.com gdzie w każdej chwili będziecie mogli powrócić do opisu.
Śledźcie nas na Facebook’u, Instagramie oraz LinkedIn, żeby być zawsze na bieżąco.
Źródła:
1. Filipe, M.I., Lake, B.D. (Eds.), 1983. Histochemistry in pathology. Churchill Livingstone, Edinburgh.
2. Oil Red O DiaPath Data Sheet
3. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Edition
4. Culling C.F.A., (1974) Handbook of histopathological and histochemical techniques Ed. 3 Butterworth, London, UK.
Comments