Oh ROSE, Yes! Part 3 / Och ROSE, tak! Część 3

Part 3. Three colours.

It's time for something for those who like to play little chemist. In order to perform a quick cytological evaluation, about which I have been writing for some time, you need to choose the staining carefully. The method must be good enough to distinguish the cell nuclei significantly from the cytoplasm. Nevertheless, for the fast method, we need to give something in return, most often it is the lack of accuracy. I must admit that today's topic caused me a lot of difficulties. Mainly because I don't want to advertise any branded products. After all, every method started somewhere in the lab and we don't have to pay just for some nice sounding brand name.

I suggest 3 methods of ROSE. The fastest of these will be a quite popular May-Gruenwald-Giemsa method. The quick HE method is the most enjoyable of the three and gives the best results. The Papanicolaou method allows us to easily capture lung squamous cancer cells, especially cells from the deeper layers of the epithelium.

MGG is a method that consists of only 3 ingredients. After making the smear, it is best to put the preparation in 70% ethanol or isopropyl alcohol, in which the material will be fixed before reaching the staining station. The slide should be rinsed, and then with the help of alcoholic eosin, methylene blue and methanol we achieve the desired effect. It does not make such an impression as the fact that we spend as much as 10 seconds on each of the reagents. Then the material can be rinsed in alcohols, xylene, mounted and is ready for evaluation. The entire method takes no more than 1.5 minutes. The preparation time is a huge plus. Worse with the quality of staining, which will help us diagnose if there are neoplastic changes, but it will be a bit harder to accurately determine the origin of the cells.

Fast HE is a method that, unfortunately, is a bit longer, but for everyone, it will be the most basic method of staining, and therefore the most famous. There is no need to change much here. After fixation, rinse the preparation with running water, then use Ehrlich's Hematoxylin, which is enough for 1 min. If it turns out that your Hematoxylin is not very strong, you can add a drop of hydrochloric acid. Then a quick rinse with ammonia water will do the same thing as 3-5 minutes in running water. Next, slide stays in the alcoholic eosin for a few seconds and we rinse out the excess in water. Alcohol, xylene and mount it. The method is a bit longer because here we will do the whole stain in just over 2 minutes, but the accuracy will be greater than in the case of MGG.

The last method is the Papanicolaou rapid staining. Here we need to prepare a rapid staining reagent that will replace several reagents from the standard staining. The ingredients are aniline blue, acid fuchsin, yellow eosin (powder), orange G (powder), phosphotungstic acid, phosphomolybdic acid, all dissolved in water. After fixing in alcohol, place the slide in Ehrlich's or Gill's Hematoxylin for 1 min. If it is too weak, we can also "strengthen" it. Then ammonia water and our freshly made reagent for about 2 min. After that, quickly into the water and quickly into the alcohol. Quickly, because the alcohol washes the staining. Xylene, mount and can be evaluated. The positive side here is remarkable accuracy and relative speed as for Papanicolaou method. The downside, however, is that accuracy is related to the repeatability that the operator must learn.

All these methods are used successfully in the diagnosis of ROSE. The only thing left is to go to the microscope and evaluate the specimen.

Source:

1) Almahmoud Idris AA, Hussain MS. Comparison of the efficacy of three stains used for detection of cytological changes in Sudanese females with breast lumps. Sudanese Journal of Public Health. 2009;4:275–77

2) Power KT. The Romanowsky stains: a review. American Journal of Medical Technology. 1982;6:519–23

3) Koss LG. Cytologic techniques, Diagnostic cytology and its histopathologic basis, Carol E Bales. (5th edition) 2006;Vol.2:1592–1601

4) Orell SR, Sherett GF, Bar WT. Fine Needle Aspiration Cytology. 4th ed. New York: Churchill Livingstone; 2005. pp. 179–82

--------------------------------------------------------------

Część 3. Trzy kolory

Pora na coś dla tych, którzy lubią pobawić się w małego chemika. Aby wykonać szybką diagnostykę cytologiczną, o której już jakiś czas piszę, trzeba dobrze dobrać barwienia. Metoda musi być na tyle dobra, żeby jądra komórkowe wyróżniały się istotnie na tle cytoplazmy. Niemniej jednak szybka metoda kosztuje, najczęściej brak dokładności. Nie ukrywam, że dzisiejszy temat sprawił mi sporo trudności. Głównie dlatego, że nie chcę reklamować żadnych produktów sygnowanych jakąś firmą. W końcu każda metoda zaczęła się gdzieś w laboratorium i nie musimy płacić tylko za jakąś ładnie brzmiącą markę.

Do ROSE proponuję 3 metody. Najszybszą z nich będzie dosyć popularna metoda May-Gruenwald-Giemsa. Metoda szybkiego HE jest najprzyjemniejszą metodą dającą spośród tych trzech najlepsze efekty. Szybka metoda Papanicolaou za to pozwala nam chociażby na łatwiejsze wychwycenie komórek raka nabłonkowego płuca, zwłaszcza komórek z głębszych warstw nabłonka.

MGG to metoda składająca się jedynie z 3 składników. Po wykonaniu rozmazu, najlepiej włożyć preparat do 70% alkoholu etylowym lub izopropylowym, w którym materiał utrwali się zanim dotrzemy do stanowiska barwiącego. Preparat należy przepłukać, a następnie kolejno przy pomocy eozyny alkoholowej, błękitu metylenowego i metanolu osiągamy upragniony efekt. Nie robi to takiego wrażenia jak fakt, że na każdy z odczynników poświęcamy aż 10 sekund. Po czym materiał możemy wypłukać w alkoholach, ksylenie, zakleić i już jest gotowy do oceny. Cała metoda nie trwa dłużej niż 1,5 minuty. Ogromnym plusem jest czas przygotowania. Gorzej z jakością barwienia, które pomoże nam ocenić czy występują zmiany neoplastyczne, ale z dokładnym określeniem pochodzenia komórek będzie już odrobinę ciężej.

Szybkie HE to metoda, która niestety jest odrobinę dłuższa ale dla każdego będzie najbardziej podstawową metodą barwienia, przez co też najbardziej znaną.

Tutaj dużo nie potrzeba zmieniać. Po utrwaleniu preparat przepłukujemy bieżącą wodą, dalej używamy Hematoksyliny Ehrlich’a, której wystarczy 1 min. Gdyby się okazało, że Wasza Hematoksylina nie jest zbyt mocna, możecie dodać kropelkę kwasu solnego. Następnie szybkie przepłukanie w wodzie amoniakalnej, zrobi to samo co 3-5 min w bieżącej wodzie. Pozostaje już kilka sekund w eozynie alkoholowej i wypłukanie nadmiaru w wodzie. Alkohol, ksylen i zaklejamy. Metoda jest odrobinę dłuższa bo tu już całość wykonamy w nieco ponad 2 minuty, ale dokładność będzie większa niż w przypadku MGG.

Ostatnia metoda to szybkie barwienie Papanicolaou. Tutaj musimy przygotować odczynnik do szybkiego barwienia, który będzie zastępował kilka pozycji ze standardowego barwienia. Skład to błękit anilinowy, kwaśna fuksyna, Eozyna żółta (proszek), Orange G (proszek), kwas fosfowolframowy, kwas fosfomolibdenowy, a wszystko rozpuszczone w wodzie. Po utrwaleniu w alkoholu, preparat umieszczamy w Hematoksylinie Ehrlich’a lub Gill’a na 1 min. Gdyby była za słaba to też możemy ją „wzmocnić”. Następnie woda amoniakalna i nasz, świeżo stworzony odczynnik na około 2 min. Po tym szybko do wody i szybko do alkoholu. Szybko dlatego, że alkohol wypłukuje barwienie. Pozostaje ksylen, zakleić i można oceniać. Plusem tutaj jest niezwykła dokładność i względna szybkość jak na tę metodę. Minusem jednak, że dokładność jest związana z powtarzalnością, której operator musi się wyuczyć.

Wszystkie te metody są stosowane w diagnostyce ROSE z powodzeniem. Pozostaje jedynie przenieść się do mikroskopu obok i zdiagnozować preparat.

Sos:

1) Almahmoud Idris AA, Hussain MS. Comparison of the efficacy of three stains used for detection of cytological changes in Sudanese females with breast lumps. Sudanese Journal of Public Health. 2009;4:275–77

2) Power KT. The Romanowsky stains: a review. American Journal of Medical Technology. 1982;6:519–23

3) Koss LG. Cytologic techniques, Diagnostic cytology and its histopathologic basis, Carol E Bales. (5th edition) 2006;Vol.2:1592–1601

4) Orell SR, Sherett GF, Bar WT. Fine Needle Aspiration Cytology. 4th ed. New York: Churchill Livingstone; 2005. pp. 179–82