Keratoses are red, rest is blue, Stain's not ready, so how You'll do?

Welcome to the new year! We seem to begin the fresh start, and somehow everything in the old way. Today I also decided to shed new light on the old one and explain one of the most popular staining, which is Papanicolaou. Many of you know it for sure, mainly because it is actually the basis in cervical cytology screening. It is also used, among the others in staining of lung or thyroid cytology. It is a very accurate staining, and the colors of the cells shimmering in pink, red, orange and blue tell us much more than in standard H&E. What os the method of this staining and for what are its reagents responsible? This is what you will find out today.

Let's start with the preparation:

1. Ehrlich's, Gill's or Harris Hematoxylin.

2. Orange G:

- Phosphorotungstic acid 0.15 g

- Orange G 5 g

- 96% Ethyl Alcohol 1000 ml

3. EA Reagent:

Here it all depends on what EA reagent we want to create. It looks like this:

EA25 EA36 EA50 EA65

Light Green SF Yellowfish 2,2 g 2,25 g 0,45 g 1,125 g

Bismarck Brown Y 0,6 g 0,5 g 0,5 g 0,5 g

Eozyna Y 2,2 g 2,25 g 2,25 g 2,25 g

Phosphorotungstic acid 1,7 g 2,2 g 2,2 g 2,2 g

Lithium carbonate 5 mg 5 mg 5 mg 5 mg

96% Ethyl Alcohol 1000 ml 1000 ml 1000 ml 1000 ml

Dissolve Bismarck brown Y in 100 ml of ethanol, Light green SF in 450 ml and Eosin also in 450 ml. After thoroughly mixing the reagents, combine them with each other. We add acid and lithium carbonate. Mix thoroughly, wait at least an hour and filter the reagent.

Methodology:

1. Rinse slides in water if they were fixed in alcohol. If they were fixed with a fixing spray, rinse them first with alcohol, and then with water.

2. Hematoxylin - 2 min

3. Water until blue. Warm water speeds up the reaction. Likewise, ammonia water.

4. Rinse in 96% ethyl alcohol - briefly

5. Now it's time for Orange G - about 1 min (depending on how strong the reagent came out)

6. 96% ethyl alcohol again. It is worth repeating the rinsing so that the dyes do not mix. We do it briefly.

7. EA reagent - about 2 min

8. It should be rinsed well and quickly in 96% ethyl alcohol

9. The next step is a xylene wash and mounting the slide.

Then what is responsible for what?

• Hematoxylin, of course, is responsible for staining the nuclei. This is due to its affinity for chromatin.

• Orange G is the first counterstaining. It stains mature and keratotic cells

• The third EA reagent (Eosin Azure) is another counterstaining and consists of the three main dyes. Light Green stains metabolically active cells such as squamous parabasal cells, columnar cells or epithelial cells from the intermediate layer. Bismarck Brown is responsible for the depth and intensity of color, which is why it is often overlooked in new reagents. Eosin is supposed to stain cytoplasm, nucleoli and erythrocytes pink

• Lithium carbonate is a color stabilizer.

• Phosphorotungstic acid keeps the pH at the same level.

If you have already lived to the end of the dry facts, here is the icing on the cake - some interesting facts:

• Although Gieorgios Papanikolaou is credited with being the father of the test, Aurel Babes was the first to screen and describe the possibility of detecting cancer cells. While the two men had different methodology and Papanikolaou was the first to use his technique, Babes should be considered a pioneer of such widespread screening.

• EA actually differs in the amount of Light Green SF and instead of using one reagent for all staining, for cytology e.g. from the lungs, where there is much more mucus, it is worth using EA65

• Fast Pap - popular so-called the Papanicolaou rapid test is not actually the same test. It is certainly fast and it stains cells similarly. If you are interested, I will describe how to do this method.

Do you have any interesting ways of doing some of the staining steps?

Or maybe some tips worth paying attention to?

Feel free to discuss.

Source:

1) Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Edition (0702042269)

2) Tasca, Luminița; Östör, Andrew G.; Babeș, Vincențiu (2002). "Aurel Babeș". International Journal of Gynecological Pathology. 21 (2): 198–202

3) Naylor, Bernard; Tasca, Luminița; Bartziota, Evangelina; Schneider, Volker (2001). "Cytopathology History: In Romania it's the Méthode Babeș-Papanicolaou". Acta Cytologica. Retrieved 13 May 2019.

4) Papanicolaou GN, Traut HF. "The diagnostic value of vaginal smears in carcinoma of the uterus". American Journal of Obstetrics and Gynecology. 1941; 42:193.

----------------------------------------------

Witajcie w nowym roku! Niby wszystko zaczynamy na nowo, a jakoś tak po staremu. Postanowiłem dziś rzucić też nowe światło na stare i wyjaśnić jedno z popularniejszych barwień jakim jest barwienie Papanicolaou. Wielu z Was na pewno kojarzy, głównie dlatego że to jest właściwie podstawa w skreeningu cytologii szyjki macicy. Wykorzystywane też jest m.in. w barwieniu cytologii płuc czy tarczycy. Jest to barwienie bardzo dokładne i czyste, a barwy komórek mieniących się w różu, czerwieni, pomarańczowym i błękicie mówią nam znacznie więcej niż w standardowym H&E. Jak wygląda to barwienie i jaki odczynnik za co odpowiada? Tego właśnie dowiecie się dzisiaj.

Zacznijmy od przygotowania:

1. Hematoksylina wg Ehrlich’a, wg Gill’a lub wg Harris’a.

2. Orange G:

- Kwas fosforowolframowy 0,15 g

- Orange G 5 g

- Alkohol Etylowy 96% 1000 ml

3. Odczynnik EA:

Tutaj wszystko zależy od tego w jaki odczynnik EA chcemy stworzyć. Wygląda to w następujący sposób:

EA25 EA36 EA50 EA65

Light Green SF Yellowfish 2,2 g 2,25 g 0,45 g 1,125 g

Bismarck Brown Y 0,6 g 0,5 g 0,5 g 0,5 g

Eozyna Y 2,2 g 2,25 g 2,25 g 2,25 g

Kwas fosforowolframowy 1,7 g 2,2 g 2,2 g 2,2 g

Węglan litu 5 mg 5 mg 5 mg 5 mg

Alkohol etylowy 96% 1000 ml 1000 ml 1000 ml 1000 ml

Należy rozpuścić Bismarck brown Y w 100 ml etanolu, Light green SF w 450 ml i Eozynę również w 450 ml. Po dokładnym wymieszaniu odczynników łączymy je ze sobą. Dodajemy kwasu i węglanu litu. Należy dokładnie wymieszać, odczekać przynajmniej godzinę i przefiltrować odczynnik.

Metodologia:

1. Płuczemy preparaty w wodzie jeśli były utrwalane w alkoholu. Jeśli były utrwalane sprayem utrwalającym, należy je w pierwszej kolejności wypłukać alkoholem, a następnie wodą.

2. Hematoksylina – 2 min

3. Woda do momentu aż otrzymamy kolor niebieski. Ciepła woda przyspiesza reakcję. Podobnie woda amoniakalna.

4. Płuczemy w alkoholu etylowym 96% - krótko

5. Teraz pora na Orange G – około 1 min (w zależności jak mocny Wam wyszedł odczynnik)

6. Znów alkohol etylowy 96%. Warto powtórzyć płukanie, tak aby barwniki się nie mieszały. Robimy to krótko.

7. Odczynnik EA – około 2 min

8. Należy dobrze i szybko wypłukać w alkoholu etylowym 96%

9. Kolejnym etapem jest płukanie w ksylenie i zaklejanie szkiełka.

W takim razie co za co odpowiada?

• Hematoksylina oczywiście odpowiada za barwienie jąder komórkowy. Spowodowane to jest jej powinowactwem do chromatyny.

• Orange G jest pierwszym kontrbarwieniem. Barwi dojrzałe i zrogowaciałe komórki

• Trzeci odczynnik EA (Eosin Azure) jest kolejnym kontrbarwieniem i składa się z trzech głównych barwników. Light Green barwi metabolicznie aktywne komórki tak jak płaskonabłonkowe komórki parabazalne, komórki cylindryczne, czy komórki nabłonkowe z pośredniej warstwy. Bismarck Brown odpowiada za głębię i intensywnośc koloru, przez co często jest pomijany w nowych odczynnikach. Eozyna ma za zadanie barwić na rózowo cytoplazmę, jąderka i erytrocyty

• Węglan litu jest stabilizatorem barwień.

• Kwas fosforowolframowy ma za zadanie utrzymać pH na jednakowym poziomie.
  

Jeśli już dotrwaliście do samego końca suchych faktów to oto wisienka na torcie - kilka ciekawostek:

• Pomimo, że to Gieorgios Papanikolaou jest uznawany za ojca znanego od jego nazwiska testy, to Aurel Babes jako pierwszy wykonał skrining i opisał możliwość wykrycia komórek nowotworowych. Co prawda obaj panowie mieli inną metodykę i Papanikolaou jako pierwszy użył swojej techniki, to Babes powinien być uznany za pioniera tak powszechnego skriningu.

• EA różni się właściwie ilością Light Green SF i zamiast używać jednego odczynnika do wszystkich barwień, to do cytologii np. z płuc, gdzie występuje znacznie więcej śluzu, warto używać EA65

• Fast Pap – popularny tzw. szybki test Papanicolaou, nie jest właściwie tym samym testem. Jest na pewno szybki oraz barwi podobnie komórki. Jeśli będziecie chętni to opiszę jak wykonać tę metodę.

Macie jakieś swoje ciekawe sposoby na niektóre etapy tego barwienia?

A może wskazówki warte uwagi?

Zapraszam do dyskusji.

Źródła:

1) Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Edition (0702042269)

2) Tasca, Luminița; Östör, Andrew G.; Babeș, Vincențiu (2002). "Aurel Babeș". International Journal of Gynecological Pathology. 21 (2): 198–202

3) Naylor, Bernard; Tasca, Luminița; Bartziota, Evangelina; Schneider, Volker (2001). "Cytopathology History: In Romania it's the Méthode Babeș-Papanicolaou". Acta Cytologica. Retrieved 13 May 2019.

4) Papanicolaou GN, Traut HF. "The diagnostic value of vaginal smears in carcinoma of the uterus". American Journal of Obstetrics and Gynecology. 1941; 42:193.