For ma' Lean / Forma Lina

1. Phonetic notation of "formalin".

2. Lean as someon skinny. Humoristic and without connection with the article.

-------------

1. Gra słowna dotycząca wyrazu "formalina".

2. Lin jako ryba słodkowodna z rodziny karpiowatych. Humorystycznie i bez związku z artykułem.

Is proper tissue fixation important? Of course! Those who worked with unfixed material know it very well. Many pathologists probably also, although often unconsciously, complain about the effects of too long fixation. Today, however, I will not deal with the general issues of this process, because it is a long topic and, contrary to appearances, very difficult, in which literally everything can go wrong. After all, for perfect fixation, the tissue should be divided into origin, size, You need to watch the time, sometimes to the single hour. Another thing is that formalin infiltration does not yet equal fixation, because while the fixative can penetrate from 1 to 2 mm per hour, the fixation process is much slower. Today, however, I am going to focus on immunohistochemistry.

Why is fixation in terms of immunohistochemistry more difficult than tissue fixation for standard H&E or even special stainings? Mainly because underfixation and overfixation can be detrimental to evaluation. The most common fixative of choice is buffered formalin. It is worth mentioning here that we can also use:

- Methanol,

- Acetone,

- Ethanol with glacial acetic acid,

- A mixture of acetone and methanol,

- A mixture of methanol and ethanol,

- Paraformaldehyde 3-4% with Triton X-100,

- Paraformaldehyde 3-4% with methanol.

Focusing on 10% formalin, or 4% formaldehyde, I have to go back little bit to the basics. The tissue should be fixed from 4 to 48 hours. In some cases, 72 hours is acceptable, especially if we are talking about a huge fragment of adipose tissue. Therefore, it is worth to cut out tumor sample first, before formalin can reach them spontaneously. Furthermore, it should be remembered that in the case of, for example, whole organs removed, the fixative lose their "momentum" over time. This means, that while the top layer is fixed very well, to the center formalin may not reach even for a week.

Okay, but what about this under- and overfixation?

In case of the underfixation of the tissue fragment, according to which we intend to determine immunohistochemical markers, we can deal with cellular autolysis. This will, of course, result in a lack of an immunohistochemical response due to protein degradation. Unfortunately, there may also be artifacts that make difficulties during evaluation. Even re-examination will not help here.

Effect of insufficient fixation on Ki-67 immunohistochemistry (IHC) in human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive cancer. Insufficient fixation caused a drastic reduction in the Ki-67 index from 33% to 5% in a HER2-positive cancer (A and B), while there was no significant change in the HER2 expression (C and D). (A and B) Ki-67 IHC; (C and D) HER2 IHC; (A and C) fixed for 48 h; (B and D) fixed for 3 h.

When it comes to overfixation, it can result in masking epitopes, impossible to unmask in retrieval solution. This will lead to false negative results. Moreover, very often nonspecific staining with diaminobenzidine is observed suggesting false positives.

Effect of prolonged fixation on Ki-67 immunohistochemistry in oestrogen receptor (ER)-positive (A) and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive (B) cancer. Prolonged fixation caused a gradual reduction in the Ki-67 index in a time-dependent manner (A and B, top), while there was no significant reduction in both ER (A, bottom) and HER2 (B, bottom) expression.

So how do you fix the tissue to make it perfect? The answer to this question should start with explaining what is happening during this process. Formalin immediately after entering the tissue binds with amino acids creating reactive groups, which in turn by binding with each other, build methylene bridges. We can realize that, for example, in the fact that the tissue becomes harder. Like any chemical process, it must take some time and, as I mentioned at the beginning, the formalin infiltration is not a fixation. In a short summary, I will present the most important points regarding this process:

1. The fixative should be at least 10 times the size of the tissue. As already mentioned, formalin loses its permeation power with tissue size, so there must be enough of it.

2. Use fresh formalin.

3. The infiltration of the tissue material is slower and slower with its size. For small materials it is 2 mm per hour, for larger materials it is 1 mm per hour on average. At least 4 hours should be counted from full infiltration until the chemical process takes place.

4. Infiltration occurs best at room temperature. By inserting the tissue at higher temperatures at first, we can cause it to close and boil, so that the fixative will not penetrate.

5. Fixing can take place at room temperature. You can speed up the process by increasing the temperature to a maximum of 40 degrees. At higher temperatures, denaturation already takes place.

6. The total fixation time should not exceed 48 hours.

7. For immunohistochemistry, select the fresh fragment of tissue and fix it separately. Absolutely no longer than 48h. Ideally, you should follow the rule: (Thickness of the selected tissue fragment in mm x 1.5h) + 8h (with a margin "+ 4h max")

Finally, one pro tip that I think is little known (if I am wrong, correct me, I didn't found this out for a long time):

- If you need to store the material before the embedding, it is best to do it in 60-70% ethyl alcohol. Keeping in formalin may lead to overfixation, and too long storage in paraffin may lead to shrinkage, twisting and excessive hardening of the tissue material, which may result in difficulties in cutting (if you want to learn more about paraffin, please read the note from November)

Source:

1. Kiernan. J.A., (1999) Histological and histochemical methods: Theory and practice, Ed. 3 Butterworth Heinemann, Oxford, UK

2. Arnold, M.M., Srivastava, S., Fredenburgh, J., et al., 1996. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic and Histochemistry 71, 224–230.

3.Fraenkel-Conrat, H., Olcott, H.S., 1948b. Reactions of formaldehyde with proteins. VI. Cross-linking of amino groups with phenol, imidazole, or indole groups. Journal of Biological Chemistry 174, 827–843.

4.Helander, K.G., 1994. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic and Histochemistry 69, 177–179.

5. O’Leary, T.J., Mason, J.T., 2004. A molecular mechanism of formalin fixation and antigen retrieval. American Journal of Clinical Pathology 122, 154; author reply 154–155

6. Arima N, Nishimura R, Osako T, et al The importance of tissue handling of surgically removed breast cancer for an accurate assessment of the Ki-67 index Journal of Clinical Pathology 2016;69:255-259.

-----------------------------

Czy odpowiednie utrwalenie tkanki ma znaczenie? Owszem, doskonale wiedzą o tym Ci, którzy pracowali z nieutrwalonym materiałem. Wielu patologów pewnie również, choć często niezbyt świadomie, narzeka na skutki zbyt długiego utrwalania. Dziś nie zajmę się jednak ogólnymi kwestiami utrwalania, bo to dość długi temat i wbrew pozorom bardzo trudny, w którym dosłownie wszystko może pójść nie tak. Do perfekcyjnego utrwalenia przecież należy dzielić tkankę na pochodzenie, wielkość, używać albo i nie odpowiedniej temperatury, pilnować czasu, niejednokrotnie co do godziny. Kolejna sprawa to fakt, że przesiąknięcie formaliną jeszcze nie równa się utrwaleniu, bo o ile formalina potrafi przenikać od 1 do 2 mm na godzinę, to proces utrwalania jest znacznie wolniejszy. Dziś jednak zamierzam poświęcić uwagę immunohistochemii.

Dlaczego utrwalanie w kwestii immunohistochemii jest trudniejsze od utrwalania tkanek do standardowego barwienia H&E czy nawet barwień specjalnych? Głównie dlatego, że niedotrwalenie (underfixation) i przetrwalenie (overfixation) może przynosić skutki utrudniające ocenę. Najczęściej wybieranym utrwalaczem jest buforowana formalina. Warto wspomnieć jednak, że możemy także korzystać z:

- Metanolu,

- Acetonu,

- Etanolu z lodowatym kwasem octowym,

- Mieszaninie acetonu i metanolu,

- Mieszaninie metanolu z etanolem,

- Paraformaldehydu 3-4% z Triton X-100,

- Paraformaldehydu 3-4% z metanolem.

Skupiając się na 10% formalinie, czyli 4% formaldehydowi, muszę wrócić odrobinę do samych podstaw. Należy utrwalać tkankę od 4 do 48 h. W niektórych wypadkach 72h jest dopuszczalne, zwłaszcza jeśli mówimy o dużej tkance tłuszczowej. Dlatego warto wycinać reprezantywny fragment w pierwszej kolejności, zanim formalina zdąży dotrzeć do niej samoistnie. Ponadto pamiętać należy, że w przypadku, np. odjętych całych organów utrwalacze tracą na pędzie z czasem. Oznacza to tyle, ze o ile wierzchnia warstwa zostanie utrwalona bardzo dobrze, o tyle do centrum formalina może nie dotrzeć nawet przez tydzień.

No dobrze, ale co z tym niedotrwaleniem i przetrwaleniem?

W przypadku niedotrwalenia fragmentu tkankowego, wedle którego zamierzamy przeprowadzać oznaczenia immunohistochemiczne, możemy mieć do czynienia z autolizą komórkową. Będzie to oczywiście skutkować brakiem odpowiedzi immunohistochemicznej z powodu degradacji białek. Niestety mogą także się pojawiać artefakty, które będą dodatkowo utrudniały ocenę. Wtedy żadne ponowne wykonanie badania nie pomoże.

Effect of insufficient fixation on Ki-67 immunohistochemistry (IHC) in human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive cancer. Insufficient fixation caused a drastic reduction in the Ki-67 index from 33% to 5% in a HER2-positive cancer (A and B), while there was no significant change in the HER2 expression (C and D). (A and B) Ki-67 IHC; (C and D) HER2 IHC; (A and C) fixed for 48 h; (B and D) fixed for 3 h.

Jeśli chodzi o przetrwalenie może ono skutkować m.in. maskowaniem epitopów, niemożliwym do ponownego ujawnienia. Będzie to prowadzić do fałszywie ujemnych wyników. Ponadto bardzo często obserwuje się niespecyficzne barwienie diaminobenzydyną sugerując z kolei wyniki fałszywie pozytywne.

Effect of prolonged fixation on Ki-67 immunohistochemistry in oestrogen receptor (ER)-positive (A) and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive (B) cancer. Prolonged fixation caused a gradual reduction in the Ki-67 index in a time-dependent manner (A and B, top), while there was no significant reduction in both ER (A, bottom) and HER2 (B, bottom) expression.

A zatem w jaki sposób utrwalać materiał, żeby było perfekcyjnie? Odpowiedź na to pytanie należy zacząć od wyjaśnienia co dzieje się podczas tego procesu. Formalina zaraz po przeniknięciu do tkanki wiąże się z aminokwasami tworząc grupy reaktywne, te z kolei wiążąc się ze sobą budują mostki metylenowe. Możemy to zauważyć chociażby w tym, że tkanka staje się twardsza. Jak każdy proces chemiczny musi to zająć trochę czasu i tak jak wspominałem na początku przepojenie formaliną to jeszcze nie utrwalenie. W krótkim podsumowaniu przedstawię najistotniejsze punkty dotyczące tego procesu:

1. Utrwalacza powinno być przynajmniej 10x więcej niż objętość tkanki. Jak już wspominałem, formalina traci siłę przepajania wraz z wielkością tkanki, musi być jej zatem wystarczająco dużo.

2. Należy używać świeżej formaliny.

3. Przepajanie materiału zachodzi coraz wolniej wraz z jego wielkością. Dla niewielkich materiałów jest to 2 mm na godzinę, dla większych średnio 1 mm na godzinę. Od przepojenia należy policzyć przynajmniej 4 h do zajścia procesu chemicznego.

4. Przepajanie zachodzi najlepiej w temperaturze pokojowej. Wkładając tkankę od razu wyższych temperatur, możemy spowodować jej zamknięcie i ugotowanie, przez co utrwalacz nie przeniknie do środka.

5. Utrwalanie zachodzić może w temperaturze pokojowej. Można proces przyspieszyć podwyższając temperaturę do max 40 stopni. W wyższych temperaturach zachodzi już denaturacja.

6. Całkowity czas utrwalania nie powinien przekraczać 48 h.

7. Dla badań immunohistochemicznych, należy wybierać jak najświeższy fragment tkanki i utrwalać go osobno. Absolutnie nie dłużej niż 48 h. Idealnie byłoby stosować się do zasady: (Grubość wybranego fragmentu tkankowego w mm x 1,5 h) + 8h (z marginesem +4h max)

Na koniec jeden pro tip, który wydaje mi się, że jest mało znany (jeśli mi się źle wydaje, to mnie upomnijcie, ja się długo o tym nie dowiedziałem):

- Jeśli trzeba przechowywać materiał przed przepojeniem w parafinie to najlepiej to robić w 60-70% alkoholu etylowym. Trzymanie w formalinie może doprowadzić do przetrwalenia, a zbyt długie przechowywanie w parafinie może skutkować obkurczaniem, skręcaniem i zbytnim utwardzeniem materiału tkankowego co może w efekcie prowadzić to trudności w krojeniu (chętnych dowiedzieć się więcej o przepajaniu parafiną zachęcam do przeczytania o niej notki z listopada)

Źródła:

1. Kiernan. J.A., (1999) Histological and histochemical methods: Theory and practice, Ed. 3 Butterworth Heinemann, Oxford, UK

2. Arnold, M.M., Srivastava, S., Fredenburgh, J., et al., 1996. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic and Histochemistry 71, 224–230.

3.Fraenkel-Conrat, H., Olcott, H.S., 1948b. Reactions of formaldehyde with proteins. VI. Cross-linking of amino groups with phenol, imidazole, or indole groups. Journal of Biological Chemistry 174, 827–843.

4.Helander, K.G., 1994. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic and Histochemistry 69, 177–179.

5. O’Leary, T.J., Mason, J.T., 2004. A molecular mechanism of formalin fixation and antigen retrieval. American Journal of Clinical Pathology 122, 154; author reply 154–155

6. Arima N, Nishimura R, Osako T, et al The importance of tissue handling of surgically removed breast cancer for an accurate assessment of the Ki-67 index Journal of Clinical Pathology 2016;69:255-259.