50 shades of Hematoxylin (1) / 50 odcieni Hematoksyliny (1)

Part 1. Dye don't dye

Hematoxylin is surely the most known reagent in histopathology. Everyone knows perfectly, beautiful, blue-stained nuclei with pink cytoplasm in the background. Only a few, however, wonder how it works. Perhaps even fewer people know, how to prepare this basic reagent.

Would You be surprised, if I’d told You, that hematoxylin isn’t a dye at all?

As you know perfectly well, and if not, you can probably guess from the title, there are at least several types of hematoxylin. They vary in content… well... of hematoxylin, metal salts, solvents, oxidants and stabilizers. Actually, to prepare this reagent needs only three basics ingredients. Those are:

1) Hematoxylin, as dye precursor

2) Metal salt, e.g. alumni disulfate

3) Solvent, the simplest is water, of course

Besides those three, we can add other ingredients. They are not obligatory but give specific properties. Those are:

1) Oxidants – allow transformation from hematoxylin (which is not a dye) into hematein (which is a dye)

2) Acids – to adjust pH, primarily for extending the useful life of the solution, but which can, depending on the solution, also affect the selectivity of the staining.

3) Stabilizers – inhibit further hematein oxidation, since this can shorten staining life and produce poorly defined nuclei

4) Additions to the solvent are also common, often to inhibit evaporation or precipitation

We already know that hematoxylin can't stain anything, so how does it work?

We owe everything to oxidants and the conversion of hematoxylin into hematein, both of which differ only in one hydrogen atom. Initially, attempts were made to achieve this with the help of atmospheric oxygen, but the hematein produced in this way was very unstable. It was able to precipitate, change colors, etc, and we need here constant diagnostic repeatability. That is why began to use mild oxidants that removed hydrogen from the hematein hydroxyl group and formed the carbonyl group. Thanks that, coordination complexes with metals such as aluminum could be established, which form a specific "bridge" between the anionic dye, hematein, and negatively charged phosphate groups of the DNA of the cell nucleus.

In a simpler view: negatively charged hematein forms a positively charged when combined with aluminum. After that reacts as a cation and attaches to tissue anions, such as phosphate groups of DNA.

Wait a minute, but where exactly do you get hematoxylin for hematoxylin?

And where are those 50 shades?

See You on Thursday!

Source:

1. Histopathology Methods and Protocols Edited by Christina E. Day, Department of Pathology, USC Keck School of Medicine, Los Angeles, CA, USA

2. Bettinger, C.H., Zimmermann, H.W., 1991. New investigations on hematoxylin, hematein, and hematein-aluminium complexes. 2. Hemateinaluminium complexes and hemalum staining. Histochemistry 96, 215–228.

3. Chayen, J., Bitensky, L., 1991. Practical histochemistry, second ed. Wiley, Chichester.

4. Horobin, R.W., 2004. Staining by numbers: a tool for understanding and assisting use of routine and special histo-pathology stains. Journal of Histotechnology 27, 23–28.

5. Lillie, R.D., 1965. Histopathologic technic and practical histochemistry, third ed. McGraw-Hill, New York.

6. Sheehan, D.C., Hrapchak, B.B., 1987. Theory and practice of histotechnology, second ed. Battelle Press, Columbus, OH.

---------------------------------------------------------

Część 1. Barwnik nie-barwnik

Hematoksylina jest zdecydowanie najbardziej znanym odczynnikiem stosowanym w histopatologii. Wszyscy doskonale kojarzą piękne, niebiesko zabarwione jądra komórkowe, na tle różowej cytoplazmy. Niewielu zastanawia się jednak, w jaki sposób ona działa. Być może jeszcze mniej osób wie jak stworzyć ten podstawowy odczynnik.

Czy bylibyście jednak zaskoczeni, gdybym powiedział, że hematoksylina nie jest barwnikiem?

Jak doskonale wiecie, a jeśli nie, to na pewno domyślacie się z tytułu, istnieje przynajmniej kilka rodzajów hematoksyliny . Różnią się one zawartością... hematoksyliny (tak, hematoksyliny), soli metali, rozpuszczalników, utleniaczy i stabilizatorów. Właściwie, żeby stworzyć ten roztwór , potrzeba trzech podstawowych odczynników. Są to:

1) Hematoksylina, jako prekursor barwnika

2) Sole metalu, np. siarczan glinu

3) Rozpuszczalnik, najprostszym jest oczywiście woda

Oprócz tych trzech, możemy dodawać inne składniki. Nie są one wymagane, ale nadają specyficzne właściwości. Są to:

1) Utleniacze – pozwalają na przekształcenie hematoksyliny (która nie jest barwnikiem) w hemateinę (która barwnikiem jest)

2) Kwasy – w celu dostosowania pH, w celu wydłużania żywotności odczynnika, ale również, w zależności od roztworu, ich wpływ na selektywność barwienia.

3) Stabilizatory – celem ich jest powstrzymanie dalszego utleniania hemateiny, co mogłoby skrócić trwałość barwienia oraz mniej wyróżniać jądra komórkowe.

4) Powszechne są także dodatki do rozpuszczalników, aby zapobiegać parowaniu czy wytrącaniu się składowych.

Już wiemy, że hematoksylina nie jest w stanie niczego zabarwić, no to jak to działa?

Wszystko zawdzięczamy utleniaczom i zamianie hematoksyliny w hemateinę, które to związki różnią się jedynie jednym atomem wodoru. Początkowo starano się to osiągnąć przy pomocy tlenu atmosferycznego, ale hemateina wytworzona w ten sposób jest bardzo niestabilna. Potrafiła się wytrącać, zmieniać kolory, a w badaniu potrzebujemy stałej powtarzalności. Zaczęto więc stosować łagodne utleniacze, które usuwały wodór z grupy hydroksylowej i tworzyły grupę karbonylową. Dzięki temu mogą powstawać kompleksy koordynacyjne z metalami takimi jak glin, który tworzy swoisty „mostek” pomiędzy anionowym barwnikiem, hemateiną, a ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi w DNA jądra komórkowego.

W prostszym sformułowaniu: ujemnie naładowana hemateina po połączeniu z glinem formuje ładunek naładowany dodatnio. Następnie reaguje jako kation i przyłącza się do anionów tkankowych, takich jak grupy fosforanowe DNA.

Zaraz, zaraz, ale skąd właściwie wziąć hematoksylinę do hematoksyliny?

I jak osiągnąć 50 odcieni?

To do czwartku.

Source:

1. Histopathology Methods and Protocols Edited by Christina E. Day, Department of Pathology, USC Keck School of Medicine, Los Angeles, CA, USA

2. Bettinger, C.H., Zimmermann, H.W., 1991. New investigations on hematoxylin, hematein, and hematein-aluminium complexes. 2. Hemateinaluminium complexes and hemalum staining. Histochemistry 96, 215–228.

3. Chayen, J., Bitensky, L., 1991. Practical histochemistry, second ed. Wiley, Chichester.

4. Horobin, R.W., 2004. Staining by numbers: a tool for understanding and assisting use of routine and special histo-pathology stains. Journal of Histotechnology 27, 23–28.

5. Lillie, R.D., 1965. Histopathologic technic and practical histochemistry, third ed. McGraw-Hill, New York.

6. Sheehan, D.C., Hrapchak, B.B., 1987. Theory and practice of histotechnology, second ed. Battelle Press, Columbus, OH.