50 shades of hematoxylin (2) / 50 odcieni Hematoksyliny (2)

Paweł Piotrowski
Nov 19, 2020
6 min read

Part 2. The hematoxylin is dead, long live the hematoxylin

We already know that hematoxylin is not a dye but a precursor. We know, that when hematein binds with aluminium, it changes its charge to a positive one, thanks to which can bind to the negatively charged phosphate groups of nucleotides. Are there any more secrets hematoxylin might hide?

To find out, we have to move to the fertile soils of Central America, because this is where the Haematoxylum campechianum tree grows, from which our main character is extracted. Dyeing fabrics in red and blue with this plant was known in antiquity. The name of the dye itself comes from the Greek words haima - blood and xylo – wood. The pictures of the tree You could find at:

https://inpn.mnhn.fr/espece/cd_nom/447042?lg=en

Hematoxylin is prepared by various methods, but the simplest is to cook sawdust from wood. They produce an orange-yellow solution which, on evaporation, gives raw hematoxylin. Its content depends on the tree and ranges from 0-10%.

We have already discovered the origin. The question is how to obtain the fifty kinds of hematoxylin mentioned. Fifty? How about eighty-one? Impressive, right?

We owe it to many factors. For example, to the dye content of the solution, which can range from 1 g per litre in Mayer's hematoxylin, to 20 times of that, in Masson's hematoxylin. This has an impact on the properties and the more hematoxylin, the more reliable we can use the regressive staining method. The dye itself, however, is not the only one that matters. Mordants also have a huge impact.

The most commonly used fixative is aluminium sulphate. Its popularity is since when hematoxylin began to be used for staining in the 19th century. This salt than was easily available and of relatively high quality. Nevertheless, other salts are also used, such as nitrates in Rawitz's hematoxylin or acetates in Haug's hematoxylin. However, these are old recipes, while newer ones, for example, Gill's, contain the popular sulfates. Other metal salts are also used, like for example in Weigert’s hematoxylin, which includes iron chloride. Other, less common metals are copper, molybdenum, bismuth and vanadium. The salt content ranges more often from 6 to 150 g/l of solvent.

Other ingredients that influence hematoxylin are acids, because not only can they maintain the pH, but also increase the selectivity in staining. You can lower the pH to such an extent that it does not stain the tissue at all, only nuclei. Krutsay's hematoxylin comes to the rescue here. Except, that nature, and in point of fact chemistry do not like inequality, so we need to give something in return. Due to the hydrochloric acid used here, calcium deposits which are a diagnostic indicator too, unfortunately, will be washed out.

The most commonly used is 2-5% acetic acid, although, as a curiosity, Langeron's hematoxylin uses 0.1% citric acid.

Summary:

1) When choosing hematoxylin, focus on the amount of dye, amount of fixative (their ratio) and pH.

2) Hematein likes to oxidize and the products of this process precipitate, so if you notice this, filter hematoxylin frequently (even every third staining). Thanks to this, you will save yourself uneven staining and crystals seen under the microscope.

3) Make test stains - this will help determine material consumption over time.

4) Play Dr Frankenstein and revive the hematoxylin with a drop of acid (if that's not enough, go bananas and add another one). Hematoxylin with a high amount of dye and fixer, maintaining a high ratio of both and a relatively low pH, will significantly extend the life of the solution.

5) Use ammonia water as a blueing agent. I highly recommend it.

Source:

1) Cole, E.C., 1943. Studies in hematoxylin stains. Stain, Technology 18, 125.

2) Gill, G.W., Frost, J.K., Miller, K.A., 1974. A new formula for half-oxidised hematoxylin solution that neither overstains or requires differentiation. Acta Cytologica 18, 300.

3) Mayer, P., 1903. Notiz über Hämatein und Hämalaun. Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie und für mikroskopische Technik 20, 409.

4) Slidders, W., 1969. A stable iron-hematoxylin solution for staining the chromatin of cell nuclei. Journal of Microscopy 90, 61.

5) Carson, F.L., 1997. Histotechnology: a self-instructional text. American Society for Clinical Pathology, Chicago, 6, 93.

6) Harris, H.F., 1900. On the rapid conversion of hematoxylin into haematein in staining reactions. Journal of Applied Microscopic Laboratory Methods 3, 777.

---------------------------------------------------------------------------------------

Część 2. Hematoksylina się zużyła, niech żyje hematoksylina.

Wiemy już, że hematoksylina to nie barwnik a jedynie prekursor. Wiemy, że hemateina wiążąc się z glinem zmienia ładunek na dodatni, dzięki czemu wiąże się z ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi nukleotydów. Czy istnieją jeszcze tajemnice, które hematoksylina mogłaby skrywać?

Aby się tego dowiedzieć, musimy się przenieść na żyzne gleby Ameryki Środkowej, bo to właśnie tam rośnie drzewo Haematoxylum campechianum – Modrzejec kampechiański, z którego ekstrahuje się naszego głównego bohatera. Barwienie tkanin na kolor czerwony i niebieski przy pomocy tej rośliny znane było już w starożytności. Natomiast sama nazwa barwnika pochodzi od greckich słów haima – krew oraz xylo – drewno. Przykładowe zdjęcia można znaleźć na:

https://inpn.mnhn.fr/espece/cd_nom/447042?lg=en

Hematoxylinę przygotowuje się różnymi metodami, ale najprostszą jest gotowanie wiórów pochodzących z drewna modrzejca . Powstaje z nich pomarańczowo-żółty roztwór, który po odparowaniu daje surową hematoksylinę. Jej zawartość zależy od drzewa i waha się od 0-10%.

Odkryliśmy już kwestię pochodzenia. Pozostaje jeszcze pytanie w jaki sposób uzyskać wspomniane pięćdziesiąt rodzajów hematoksyliny. Pięćdziesiąt? A co powiecie na osiemdziesiąt jeden? Robi wrażenie prawda?

Zawdzięczamy to wielu czynnikom. Chociażby zawartości barwnika w roztworze, który może wynosić od 1g na litr w hematoksylinie wg Mayer’a, do dwudziestokrotności w hematoksylinie wg Masson’a. Nie pozostaje to bez wpływu na właściwości i im więcej hematoksyliny tym pewniej możemy używać metody regresywnej barwienia. Sam barwnik jednak nie jest jedynym, który ma znaczenie. Ogromny wpływ ma także utrwalacz.

Najczęściej wykorzystywanym utrwalaczem jest siarczan glinu. Jego popularność wynika z tego, że kiedy w XIX wieku zaczęto używać hematoksyliny, był on łatwo dostępny i posiadał względnie wysoką jakość. Niemniej jednak używane są także inne sole, jak np. azotany w hematoksylinie wg Rawitz’a, czy octany w hematoksylinie Haug’a. Są to, co prawda, stare receptury, natomiast nowsze jak przykładowo hematoksylina wg Gill’a, zawierają popularne siarczany. Używa się także soli innych metali, chociażby w hematoksylinie wg Weigerta, której składową jest chlorek żelaza. Innymi, mniej popularnymi metalami są: miedź, molibden, bizmut czy wanad. Zawartość soli waha się od 6 do ok 150 g/l rozpuszczalnika.

Innymi składnikami, które wpływają na hematoksylinę są kwasy, ponieważ nie tylko możemy dzięki nim utrzymać pH ale także zwiększać selektywność w barwieniu. Można obniżyć pH do takiego stopnia aby nie barwić tkanki w ogóle, a jedynie jądra komórkowe. Z pomocą przychodzi tutaj hematoksylina wg Krutsay’a.. Tyle, że przyroda, a tym bardziej chemia nie lubi nierówności, tak więc musimy poświęcić coś w zamian. Ze względu na użyty tu kwas solny, złogi wapniowe, które są także wskaźnikiem diagnostycznym, zostaną wypłukane.

Najczęściej używany jest 2-5% kwas octowy, chociaż, jako ciekawostka, w hematoksylinie wg Langeron’a używa się 0,1% kwasu cytrynowego.

Podsumowanie:

1) Wybierając hematoksylinę skupcie się na: ilości barwnika, ilości utrwalacza (i ich stosunku) oraz pH.

2) Hemateina lubi się utleniać, a produkty tego procesu wytrącać, dlatego jeśli to zauważycie, filtrujcie hematoksylinę często (nawet co trzecie barwienie). Dzięki temu oszczędzimy sobie nierównomiernego barwienia i mikroskopijnych kryształków na preparacie.

3) Wykonujcie testowe barwienia - z czasem pomoże to określić zużycie materiału.

4) Pobawcie się we dr Frankenstein'a i ożywcie hematoksylinę kroplą kwasu (jeśli to za mało to zaszalejcie i dodajcie drugą). Hematoksylina o dużej ilości barwnika i utrwalacza, zachowująca wysoki stosunek obu? oraz względnie niskim pH, znacząco przedłuży żywotność.

5) Używajcie wody amoniakalnej do zniebieszczenia. Polecam serdecznie.