Czyli jak mała biopsja znika po kawałku, zanim zdążymy zrobić wszystko, czego od niej oczekujemy

Tissue stewardship to świadome gospodarowanie materiałem tkankowym tak, aby wystarczył zarówno do diagnostyki histopatologicznej i immunohistochemii, jak i do badań predykcyjnych oraz NGS.

Jest bloczek. Niewielki. Może nawet bardzo niewielki.

Kilka fragmentów materiału pobranego z płuca. Nic spektakularnego. Patolog patrzy na H&E i wie, że trzeba odpowiedzieć na pozornie proste pytanie:

Co to jest?

Tyle że w 2026 roku odpowiedź „rak gruczołowy” jest często dopiero początkiem, bo za chwilę pojawiają się kolejne pytania.

• Czy jest ekspresja PD-L1?
• Czy są zmiany molekularne istotne terapeutycznie?
• Czy materiał nadaje się do NGS?
• Czy potrzebujemy FISH albo ISH?
• Czy trzeba wykonać dodatkową immunohistochemię?

I nagle ten niepozorny bloczek staje się jednym z najcenniejszych zasobów w całym procesie diagnostycznym. Problem polega na tym, że bloczek ma pewną bardzo nieprzyjemną właściwość.

Nie regeneruje się.

Pierwszy cut

Najpierw trymowanie. Później H&E. Potem drugi poziom, bo pierwszy nie jest idealny. Następnie immunohistochemia.

• TTF-1.
• p40.
• Może Napsin A.
• Może marker neuroendokrynny.

Jeszcze jedno szkiełko. I jeszcze jedno… zróbmy „serię”.

Another cut bites the dust.

Każde cięcie mikrotomu przesuwa nas głębiej w bloczek. Każde szkiełko wykorzystuje fragment materiału, którego już nie odzyskamy w pierwotnej postaci. I zazwyczaj nie jest to problem. No, chyba że właśnie nim się stało.

Mała biopsja. Wielkie oczekiwania.

Współczesna diagnostyka raka płuca jest chyba jednym z najlepszych przykładów tego paradoksu. Materiał pobieramy coraz mniej inwazyjnie co jest świetne. Mniejsze biopsje oznaczają mniejsze obciążenie dla pacjenta. Jednocześnie jednak od tej niewielkiej ilości tkanki oczekujemy coraz więcej.

College of American Pathologists razem z szeregiem organizacji zajmujących się pulmonologią, cytopatologią i diagnostyką molekularną stworzył osobne zalecenia dotyczące właśnie pobierania, przetwarzania i triage’u małych biopsji oraz materiału cytologicznego klatki piersiowej. Powód jest prosty: materiał ma wystarczyć nie tylko do rozpoznania morfologicznego, lecz również do badań dodatkowych — immunohistochemii, FISH, badań molekularnych czy innych testów niezbędnych do dalszego leczenia. Co ciekawe, wytyczne te zostały ponownie potwierdzone przez CAP w lutym 2026 roku.

I tu pojawia się pojęcie, które powinno wisieć nad każdym mikrotomem obok instrukcji bezpieczeństwa:

Tissue stewardship – Czyli rozsądne gospodarowanie materiałem.

Nie „oszczędzanie za wszelką cenę”, nie „nie róbmy badań”, tylko:

zróbmy dokładnie te badania, które są potrzebne — i zostawmy wystarczająco dużo materiału na następny etap diagnostyki.

Najdroższe badanie może kosztować… jedno niepotrzebne IHC

Oczywiście nie chodzi o cenę odczynnika, tylko o cenę biologiczną. Jeżeli mamy dużą resekcję, kilka dodatkowych szkiełek zazwyczaj nie robi większego wrażenia. Jeżeli jednak mamy trzy drobne fragmenty w biopsji, sytuacja wygląda zupełnie inaczej. Dlatego właśnie w diagnostyce małych biopsji płuca od lat podkreśla się znaczenie ograniczonego, dobrze dobranego panelu IHC.

W odpowiedniej sytuacji morfologia powinna zrobić tyle pracy, ile może zrobić sama. Natomiast kiedy potrzebna jest immunohistochemia, kombinacja odpowiednio dobranych markerów — klasycznie m.in. TTF-1 dla różnicowania gruczołowego i p40 dla płaskonabłonkowego — może pozwolić sklasyfikować znaczną część niedrobnokomórkowych raków płuca przy minimalnym zużyciu tkanki. W jednej z analiz obejmujących ograniczone biopsje zastosowanie TTF-1 i p40 pozwoliło prawidłowo sklasyfikować zdecydowaną większość przypadków wymagających immunohistochemicznego różnicowania.

I właśnie tutaj pojawia się pewna pokusa. Skoro mamy automat IHC i skoro przeciwciało jest dostępne… skoro „może się przydać”… to aż żal go nie zrobić. Bo przecież bloczek nie wie, że robimy badanie „na wszelki wypadek”. Dla niego każde szkiełko kosztuje dokładnie tyle samo materiału.

Death by a thousand sections

Rzadko zdarza się, że materiał zostaje zużyty jednym spektakularnym ruchem. Rzadko nie oznacza, że nigdy, ale znacznie częściej umiera powoli.

• H&E.
• Dodatkowy poziom.
• TTF-1.
• p40.
• Napsin A.
• PanCK.
• Synaptofizyna.
• Jeszcze jeden marker.
• Powtórka jednego barwienia.
• Kilka szkiełek niezabarwionych.
• PD-L1.
• I nagle ktoś pyta:

„A bloczek na molekularne?”… 

Cisza.

To właśnie prawdziwe death by a thousand sections. Nie jedna katastrofalna decyzja a sto małych, całkowicie rozsądnie wyglądających decyzji, które razem doprowadziły do sytuacji, w której materiału jest za mało. I dlatego planowanie badań zaczyna się coraz bardziej przypominać zarządzanie budżetem.

Diagnostyczny budżet tkankowy

Można spojrzeć na bloczek jak na konto. Na początku mamy określony kapitał. Nie wiemy dokładnie, ile będzie potrzebne na później, ale wiemy, że kolejne etapy mogą obejmować:

morfologię → IHC diagnostyczne → biomarkery predykcyjne → diagnostykę molekularną.

Jeżeli wydamy wszystko na pierwszym etapie, nie dostaniemy zwiększenia limitu.

CAP/IASLC/AMP już w swoich rekomendacjach dotyczących diagnostyki molekularnej raka płuca zwracały uwagę na potrzebę zachowania materiału również na badania przewidujące odpowiedź na leczenie. Zwracano też uwagę na korzyść panelowego badania wielu zmian molekularnych zamiast kolejnego zużywania materiału w serii pojedynczych testów. I to właśnie zmienia sposób myślenia. Pytanie nie brzmi już:

„Czy możemy zrobić kolejne badanie?”

Tylko:

„Czy wynik tego badania zmieni nasze rozpoznanie albo dalsze postępowanie na tyle, że warto wykorzystać na nie kolejną część materiału?”

To pozornie niewielka różnica. W praktyce — ogromna.

A może po prostu pobierzmy więcej materiału?

Oczywiście byłoby idealnie. Tyle że pacjent nie jest magazynem bloczków parafinowych. Ponowna biopsja może oznaczać kolejną procedurę, kolejne oczekiwanie, kolejne ryzyko i opóźnienie decyzji terapeutycznej. Z tym wiąże się nie tylko dyskomfort pacjenta ale przede wszystkim koszty.

Właśnie dlatego wytyczne CAP dotyczące małych biopsji klatki piersiowej zajmują się nie tylko tym, co zrobić już w laboratorium, ale również sposobem pobierania materiału, liczbą pasaży, oceną jego adekwatności czy zastosowaniem ROSE tam, gdzie jest dostępne i uzasadnione. Celem jest między innymi zwiększenie szansy na uzyskanie materiału wystarczającego zarówno do rozpoznania, jak i badań dodatkowych.

Tissue stewardship zaczyna się więc jeszcze zanim bloczek trafi do mikrotomu.

A właściwie — zanim w ogóle powstanie.

Kiedy Dust wraca do życia

I teraz dochodzimy do chyba najciekawszej części tej historii. Bo co, jeśli materiał naprawdę się skończył? Czy wykorzystane szkiełko jest już tylko dokumentacją?

Niekoniecznie.

W kwietniu 2026 roku w czasopiśmie Pathology opublikowano pracę o bardzo wdzięcznym tytule:

„Upcycling pathology”

Autorzy postanowili sprawdzić, czy materiał z wcześniej wykonanych preparatów H&E oraz preparatów immunohistochemicznych można ponownie wykorzystać do diagnostyki molekularnej.

Do badania wybrano 40 biopsji raka płuca. Preparaty zostały najpierw zdigitalizowane, aby zachować ich obraz diagnostyczny. Następnie tkankę znajdującą się na wykorzystanych wcześniej szkiełkach poddano ekstrakcji DNA i celowanemu NGS. Rezultat?

Sekwencjonowanie udało się uzyskać w 33 z 40 przypadków — 82,5%. W 30 przypadkach wykryte warianty były w pełni zgodne z materiałem referencyjnym, a w pozostałych trzech zgodność była częściowa. Autorzy zaznaczają jednocześnie, że jakość pozyskanego DNA była gorsza i metoda wymaga dalszej walidacji. To nie oznacza oczywiście:

„spokojnie, zużywajmy bloczek, najwyżej zeskrobiemy H&E”.

Wręcz przeciwnie. Najlepszym rozwiązaniem nadal jest odpowiednie gospodarowanie materiałem od samego początku, ale badanie pokazuje coś niezwykle ciekawego. Preparat, który jeszcze niedawno uznalibyśmy za końcowy produkt procesu diagnostycznego, może potencjalnie stać się ponownie materiałem wyjściowym do kolejnego badania. To trochę patologiczny recycling.

Albo — jak nazwali to autorzy — upcycling.

Nie chodzi o mniej badań

To chyba najważniejsza rzecz. Tissue stewardship nie polega na robieniu mniejszej diagnostyki. Polega na robieniu jej mądrzej.

• Na wykorzystaniu morfologii wtedy, kiedy morfologia rzeczywiście daje odpowiedź.
• Na stosowaniu celowanych paneli zamiast immunohistochemicznego „shotguna”.
• Na świadomości, jakie badania mogą być potrzebne za godzinę, jutro albo za tydzień.
• Na komunikacji między patologiem, histotechnikiem, cytologiem, biologiem molekularnym i lekarzem pobierającym materiał.
• I wreszcie — na pamiętaniu, że cienki, kilkumikrometrowy skrawek tkanki może mieć znacznie większą wartość niż sugerowałaby jego wielkość.

Bo czasami właśnie w tym jednym fragmencie znajduje się informacja, która zdecyduje o kolejnym leczeniu pacjenta. Dlatego następnym razem, kiedy mikrotom wykona kolejny obrót…

warto przez sekundę pomyśleć:

Another cut bites the dust.

Tylko oby nie ten, którego będziemy później potrzebować.

PS: a może problem zaczyna się jeszcze przed pierwszym cięciem?

Jest jeszcze jeden element tej historii, o którym warto pamiętać.

Materiał wykorzystany w opisanym wcześniej eksperymencie z „upcyclingiem” preparatów H&E i IHC był materiałem utrwalanym w formalinie, a formalina nie jest dla kwasów nukleinowych obojętna.

Utrwalanie formalinowe prowadzi m.in. do sieciowania biomolekuł, fragmentacji kwasów nukleinowych i powstawania artefaktów, które mogą komplikować późniejsze analizy molekularne. I mimo że współczesne testy NGS potrafią bardzo dobrze pracować z materiałem FFPE, w dużej mierze nauczyliśmy się po prostu radzić sobie z ograniczeniami utrwalacza stosowanego od ponad stu lat.

I tutaj robi się naprawdę ciekawie.

Jedną z potencjalnych alternatyw jest GAF — Glyoxal Acid-Free, czyli pozbawiony kwasów utrwalacz na bazie glioksalu. W wieloośrodkowym badaniu porównawczym GAF wykazał nie gorszą od buforowanej formaliny jakość diagnostyczną i zachowanie morfologii w badanych tkankach. Wcześniejsze badania wykazały również porównywalne wyniki immunohistochemiczne i molekularne, przy jednocześnie lepszym zachowaniu dłuższych fragmentów DNA w materiale utrwalanym GAF. Nowsze publikacje zwracają uwagę także na potencjalną przewagę GAF w zachowaniu DNA i RNA istotnego dla nowoczesnych metod molekularnych, w tym NGS. To kierunek szczególnie interesujący właśnie w kontekście tissue stewardship — bo jeżeli zaczynamy myśleć o każdym fragmencie tkanki jako o potencjalnym materiale nie tylko do H&E i IHC, ale również do późniejszej diagnostyki molekularnej, sposób utrwalenia materiału może mieć znaczenie długo po wykonaniu pierwszego preparatu.

I tutaj można zadać przewrotne pytanie.

Skoro udało się odzyskać DNA do NGS z wcześniej zabarwionych preparatów H&E i IHC utrwalanych formaliną…

to co byłoby możliwe, gdyby materiał od samego początku utrwalono metodą lepiej zachowującą kwasy nukleinowe?

Na to pytanie nie mamy jeszcze wystarczających danych, żeby odpowiedzieć: „problem rozwiązany”. Potrzebne są dalsze badania i walidacja konkretnych procedur, ale właśnie dlatego jest to tak interesujący kierunek. Być może kiedyś preparat H&E przestanie być postrzegany wyłącznie jako końcowy produkt diagnostyki morfologicznej. W sytuacji krytycznego niedoboru materiału może stać się rezerwowym źródłem materiału do kolejnych badań molekularnych.

I jeszcze jedna rzecz: bezpieczeństwo

Formaldehyd jest substancją toksyczną i rakotwórczą, dlatego od lat rozwijane są systemy mające ograniczać ekspozycję personelu. Pojemniki z formaliną uwalnianą dopiero po zamknięciu czy systemy zamknięte są niewątpliwie krokiem naprzód. Badania pokazują, że mogą istotnie ograniczać kontakt z formaldehydem podczas pobierania i transportu materiału. Tyle że nie dla personelu zakładów patologii.

A przede wszystkim nie zmieniają podstawowej rzeczy:

w środku nadal znajduje się formalina.

Taki system może bardzo dobrze chronić osobę pobierającą biopsję.  Nie powoduje jednak, że formaldehyd magicznie znika z dalszego procesu.

Rozmawiając kiedyś z lekarzami operatorami na pytanie co sądzą o pojemnikach z formaliną w korku otrzymaliśmy odpowiedź „nie interesuje mnie to”. Dlaczego? Bo nie oni chowają bioptaty „tylko asystentki” – brutalne, choć prawdziwe. A później materiał trzeba odebrać, otworzyć, opracować makroskopowo i dalej przetwarzać. To właśnie podczas pracy w zakładach patomorfologii — szczególnie przy opracowaniu materiału — nadal dochodzi do ekspozycji zawodowej, dlatego konieczne pozostają odpowiednia wentylacja, stanowiska grossingowe i kontrola stężeń formaldehydu. Co zatem daje „nowoczesna ochrona przed ekspozycją”? No nic.

Dlatego warto zadać jeszcze jedno pytanie:

czy chcemy przez kolejne dekady budować coraz bardziej skomplikowane systemy chroniące ludzi przed formaliną — czy równolegle powinniśmy znacznie poważniej badać możliwość zastąpienia samej formaliny?

GAF nie powinien być traktowany jako magiczne rozwiązanie, które można jutro bez walidacji wstawić do każdego laboratorium. Zmiana utrwalacza oznacza konieczność walidacji morfologii, IHC, ISH oraz metod molekularnych stosowanych w danym zakładzie ale dostępne wyniki sprawiają, że trudno już traktować alternatywy dla formaliny wyłącznie jako laboratoryjną ciekawostkę. Sami testowaliśmy substytut w wielu zakładach – z niesamowitymi efektami.

Jeżeli przyszłość patomorfologii oznacza, że z coraz mniejszych fragmentów tkanki będziemy chcieli uzyskać coraz więcej informacji, to tissue stewardship może oznaczać nie tylko:

„ile razy możemy jeszcze przeciąć ten bloczek?”, a

„W czym ten bloczek został utrwalony?”

Publikacje i wytyczne

Roy-Chowdhuri S. i wsp. — Collection and Handling of Thoracic Small Biopsy and Cytology Specimens for Ancillary Studies. Wytyczne CAP dotyczące pobierania, przygotowania i gospodarowania małymi biopsjami oraz materiałem cytologicznym z klatki piersiowej; pierwotnie 2020, ponownie potwierdzone przez CAP w lutym 2026 r. CAP — wytyczne i pełne informacje

„Upcycling pathology”: targeted next-generation sequencing is feasible in re-purposed H&E and immunostained FFPE sections in lung cancer biopsies. Pathology, 2026. DOI: 10.1016/j.pathol.2025.12.009. Abstrakt w Pathology

CAP/IASLC/AMP — Molecular Testing Guideline for Lung Cancer. CAP — Molecular Testing Guideline

Best Practices Recommendations for Diagnostic Immunohistochemistry in Lung Cancer.

Application of the 5th WHO Guidelines for the Diagnosis of Lung Carcinoma in Small Lung Biopsies.

Characterization of NSCLC in Limited Biopsy Samples and Identifying Optimal Immunohistochemical Marker Combinations.